Generazione efficiente di cellule T del recettore chimerico murino dell'antigene (CAR)-T
Summary
Questo protocollo semplifica la produzione di vettori retrovirali e la trasduzione delle cellule T murine, facilitando la generazione efficiente di cellule CAR-T di topo.
Abstract
Le terapie cellulari ingegnerizzate che utilizzano cellule T del recettore chimerico dell’antigene (CAR)-T hanno raggiunto una notevole efficacia in individui con neoplasie ematologiche e sono attualmente in fase di sviluppo per il trattamento di diversi tumori solidi. Finora, la valutazione preliminare di nuovi prodotti a base di cellule CAR-T ha avuto luogo prevalentemente in modelli tumorali xenotrapiantati utilizzando topi immunodeficienti. Questo approccio è stato scelto per facilitare il successo dell’attecchimento delle cellule CAR-T umane in ambito sperimentale. Tuttavia, i modelli murini singetici, in cui i tumori e le cellule CAR-T derivano dallo stesso ceppo murino, consentono di valutare le nuove tecnologie CAR nel contesto di un sistema immunitario funzionale e di un microambiente tumorale completo (TME). Il protocollo qui descritto mira a semplificare il processo di generazione di cellule CAR-T di topo presentando metodi standardizzati per la trasduzione retrovirale e la coltura di cellule T ex vivo . I metodi descritti in questo protocollo possono essere applicati ad altri costrutti CAR oltre a quelli utilizzati in questo studio per consentire la valutazione di routine di nuove tecnologie CAR in sistemi immuno-competenti.
Introduction
Le terapie adottive con cellule T che esprimono recettori chimerici dell’antigene (CAR) hanno rivoluzionato il campo dell’immunoterapia del cancro sfruttando la potenza del sistema immunitario adattativo per colpire ed eliminare in modo specifico le cellule tumorali positive all’antigene1. Mentre il successo delle terapie cellulari CAR-T mirate alle neoplasie a cellule B è stato clinicamente convalidato, gli studi preclinici eseguiti su modelli animali rimangono vitali per lo sviluppo di nuove CAR mirate ai tumori solidi. Tuttavia, finora è stata dimostrata un’efficacia clinica limitata nelle indicazioni per i tumori solidi e sta diventando sempre più evidente che i singoli modelli preclinici non predicono con precisione la farmacodinamica e l’efficacia clinica di un farmaco vivente 2,3. Pertanto, i ricercatori hanno iniziato ad espandere lo studio preclinico dei prodotti a base di cellule CAR-T per includere valutazioni parallele in modelli xenotrapianti e singenici di tumori umani e murini, rispettivamente.
A differenza dei modelli di xenotrapianto, in cui i tumori umani e le cellule T vengono innestati in topi immunodeficienti, i modelli singenici consentono di esaminare le risposte delle cellule CAR-T nel contesto di un sistema immunitario funzionale. In particolare, i topi immunocompetenti portatori di tumori singenici forniscono un sistema per studiare l’interazione tra le cellule T trasferite adottivamente e gli ambienti specifici del contesto, compresi i macrofagi associati al tumore (TAM) e le cellule T regolatorie (Treg) note per sopprimere la funzione delle cellule T nel microambiente tumorale (TME)4,5,6. Inoltre, i modelli singenici offrono un’ulteriore piattaforma per valutare la tossicità on-target, off-tumor e l’interazione delle cellule CAR-T con i fattori dell’ospite che possono portare a tossicità aggiuntive, tra cui la sindrome da rilascio di citochine7.
Nonostante questi vantaggi, il numero di studi singenici sulle cellule CAR-T rimane limitato. In particolare, i modelli singenici richiedono l’ingegnerizzazione autologa di cellule CAR-T dello stesso ceppo murino e quindi presentano un’ulteriore sfida a causa della mancanza di una metodologia per un’efficiente trasduzione delle cellule T murine e l’espansione ex vivo 2,8. Questo protocollo delinea i metodi per ottenere un’espressione stabile di CAR attraverso la produzione di vettori retrovirali e la trasduzione ottimizzata delle cellule T. Uno schema dell’intero processo è mostrato nella Figura 1. L’uso di questo approccio dimostra un’efficiente trasduzione retrovirale delle cellule CAR-T murine e il raggiungimento di un’elevata espressione di CAR senza la necessità di concentrazione virale attraverso l’ultracentrifugazione. Vengono discusse le strategie per modificare la specificità dell’antigene del costrutto CAR in aggiunta alla co-espressione di ulteriori transgeni.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo descrive le fasi e i reagenti necessari per la trasduzione retrovirale delle cellule T murine per generare cellule CAR-T per studi in vivo . L’ottimizzazione delle condizioni di trasduzione retrovirale consente di ottenere una robusta espressione di CAR senza la necessità di concentrazione virale attraverso l’ultracentrifugazione o reagenti aggiuntivi. Tuttavia, ci sono diverse modifiche che possono essere applicate a questa metodologia.
Mentre questo protocollo des…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Si ringrazia L. Brockmann per la revisione critica del manoscritto. Questo lavoro è stato supportato da NIH 1R01EB030352 e UL1 TR001873.
Materials
| 0.45 μm filters | MilliporeSigma | SLHVR33RS | |
| 1 mL syringe | Fisher Scientific | 14-955-450 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-135 | |
| 10 mL syringe | BD | 14-823-16E | |
| 100 μm strainer | Corning | 07-201-432 | |
| 15 cm TC treated cell culture dishes | ThermoFisher Scientific | 130183 | |
| 15 mL conical tubes | Falcon | 14-959-70C | |
| 40 μm strainer | Corning | 07-201-430 | |
| 50 mL conical tubes | Falcon | 14-959-49A | |
| 70 μm strainer | Corning | 07-201-431 | |
| Attune NxT Flow Cytometer | ThermoFisher Scientific | ||
| BALB/C, 6-8 week old | Jackson Laboratory | 651 | |
| B-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | |
| Bovine Serum Albumin | GOLDBIO | A-420-500 | |
| DMEM Medium | Gibco | 11965092 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS), without Calcium and Magnesium | Gibco | 14-190-250 | |
| DynaMag-2 Magnet | Invitrogen | 12-321-D | |
| EasySep Magnet | Stemcell Technologies | 18000 | |
| EasySep Mouse T cell Isolation Kit | Stemcell Technologies | 19851 | |
| FACS buffer | BD | BDB554657 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Corning | MT35011CV | |
| GlutaMAX | Gibco | 35-050-061 | |
| G-Rex6 | Wilson Wolf | 80240M | |
| HEPES Buffer Solution | Gibco | 15-630-080 | |
| Human recombinant IL-15 | Miltenyi Biotec | 130-095-765 | |
| Human recombinant IL-2 | Miltenyi Biotec | 130-097-748 | |
| Human recombinant IL-7 | Miltenyi Biotec | 130-095-363 | |
| Lipofectamine 3000 | Invitrogen | L3000008 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Gibco | 11140-050 | |
| Mouse Anti-CD3 BV421 | Biolegend | 100228 | |
| Mouse Anti-CD3/CD28 Dynabeads | Gibco | 11-453-D | |
| Mouse Anti-CD4 BV605 | BD | 563151 | |
| Mouse Anti-CD44 APC | Biolegend | 103011 | |
| Mouse Anti-CD62L PE-Cy7 | Tonbo | SKU 60-0621-U025 | |
| Mouse Anti-CD8 APC-Cy7 | Tonbo | SKU 25-0081-U025 | |
| Nikon Ti2 with Prime 95B camera | Nikon | ||
| Non-treated 24 well plates | CytoOne | CC7672-7524 | |
| Opti-MEM | Gibco | 31-985-062 | |
| pCL-Eco | Addgene | #12371 | |
| Penicillin/Streptomycin Solution | Gibco | 15-070-063 | |
| Phoenix Eco cells | ATCC | CRL-3214 | |
| pMDG.2 | Addgene | #12259 | |
| pMSCV_PGK_GFP28z | N/A | Produced by R.LV. | |
| Purified sfGFP | N/A | Produced by R.LV. | |
| RetroNectin ('transduction reagent') | Takara Bio | T100B | |
| RPMI 1640 | Gibco | 21875 | |
| Serological pipette 10 mL | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
| Serological pipette 25 mL | Fisher Scientific | 13-678-11 | |
| Serological pipette 5 mL | Fisher Scientific | 13-678-11D | |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11-360-070 | |
| TC-treated 24 well plates | Corning | 08-772-1 | |
| Trypan blue | Gibco | 15-250-061 |
Riferimenti
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