Generación eficiente de células T con receptor de antígeno quimérico (CAR) murino
Summary
Este protocolo agiliza la producción de vectores retrovirales y la transducción de células T murinas, lo que facilita la generación eficiente de células CAR-T de ratón.
Abstract
Las terapias celulares diseñadas que utilizan células T receptoras de antígenos quiméricos (CAR) han logrado una eficacia notable en individuos con neoplasias malignas hematológicas y actualmente están en desarrollo para el tratamiento de diversos tumores sólidos. Hasta ahora, la evaluación preliminar de nuevos productos de células CAR-T se ha llevado a cabo predominantemente en modelos tumorales de xenoinjertos utilizando ratones inmunodeficientes. Este enfoque se elige para facilitar el injerto exitoso de células CAR-T humanas en el entorno experimental. Sin embargo, los modelos de ratón singénicos, en los que los tumores y las células CAR-T se derivan de la misma cepa de ratón, permiten evaluar nuevas tecnologías de CAR en el contexto de un sistema inmunitario funcional y un microambiente tumoral integral (TME). El protocolo descrito aquí tiene como objetivo agilizar el proceso de generación de células CAR-T de ratón mediante la presentación de métodos estandarizados para la transducción retroviral y el cultivo ex vivo de células T. Los métodos descritos en este protocolo se pueden aplicar a otras construcciones de CAR más allá de las utilizadas en este estudio para permitir la evaluación rutinaria de nuevas tecnologías de CAR en sistemas inmunocompetentes.
Introduction
Las terapias adoptivas de células T que expresan receptores de antígenos quiméricos (CAR) han revolucionado el campo de la inmunoterapia contra el cáncer al aprovechar el poder del sistema inmunitario adaptativo para atacar y eliminar específicamente las células cancerosas con antígeno positivo1. Si bien el éxito de las terapias de células CAR-T dirigidas a las neoplasias malignas de células B ha sido validado clínicamente, los estudios preclínicos realizados en modelos animales siguen siendo vitales para el desarrollo de nuevos CAR dirigidos a tumores sólidos. Sin embargo, hasta el momento se ha demostrado una eficacia clínica limitada en las indicaciones de tumores sólidos, y cada vez es más evidente que los modelos preclínicos individuales no predicen con precisión la farmacodinámica y la eficacia clínica de un medicamento vivo 2,3. Por lo tanto, los investigadores han comenzado a ampliar el estudio preclínico de los productos de células CAR-T para incluir evaluaciones paralelas en modelos de xenoinjertos y singénicos de cánceres humanos y murinos, respectivamente.
A diferencia de los modelos de xenoinjertos, en los que los tumores humanos y las células T se injertan en ratones inmunodeficientes, los modelos singénicos permiten examinar las respuestas de las células CAR-T en el contexto de un sistema inmunitario funcional. Específicamente, los ratones inmunocompetentes portadores de tumores singénicos proporcionan un sistema para estudiar la interacción entre las células T transferidas adoptivamente y los entornos específicos del contexto, incluidos los macrófagos asociados al tumor (TAM) y las células T reguladoras (Treg) que se sabe que suprimen la función de las células T en el microambiente tumoral (TME)4,5,6. Además, los modelos singénicos ofrecen una plataforma adicional para evaluar la toxicidad en el objetivo, fuera del tumor y la interacción de las células CAR-T con los factores del huésped que pueden conducir a toxicidades adicionales, incluido el síndrome de liberación de citocinas7.
A pesar de estas ventajas, el número de estudios de células CAR-T singénicas sigue siendo limitado. En particular, los modelos singénicos requieren ingeniería autóloga de células CAR-T de la misma cepa de ratón y, por lo tanto, presentan un desafío adicional debido a la falta de metodología para la transducción eficiente de células T murinas y la expansión ex vivo 2,8. Este protocolo describe los métodos para lograr una expresión estable de CAR a través de la producción de vectores retrovirales y la transducción optimizada de células T. En la Figura 1 se muestra un esquema de todo el proceso. El uso de este enfoque demuestra la transducción retroviral eficiente de células CAR-T murinas y el logro de una alta expresión de CAR sin la necesidad de concentración viral a través de la ultracentrifugación. Se discuten estrategias para cambiar la especificidad antigénica de la construcción CAR, además de la coexpresión de transgenes adicionales.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo describe los pasos y reactivos necesarios para la transducción retroviral de células T murinas para generar células CAR-T para estudios in vivo . La optimización de las condiciones de transducción retroviral logra una expresión robusta de CAR sin la necesidad de concentración viral a través de ultracentrifugación o reactivos adicionales. Sin embargo, existen múltiples modificaciones que se pueden aplicar a esta metodología.
Si bien este protocolo describe el …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a L. Brockmann por la revisión crítica del manuscrito. Este trabajo fue apoyado por NIH 1R01EB030352 y UL1 TR001873.
Materials
| 0.45 μm filters | MilliporeSigma | SLHVR33RS | |
| 1 mL syringe | Fisher Scientific | 14-955-450 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-135 | |
| 10 mL syringe | BD | 14-823-16E | |
| 100 μm strainer | Corning | 07-201-432 | |
| 15 cm TC treated cell culture dishes | ThermoFisher Scientific | 130183 | |
| 15 mL conical tubes | Falcon | 14-959-70C | |
| 40 μm strainer | Corning | 07-201-430 | |
| 50 mL conical tubes | Falcon | 14-959-49A | |
| 70 μm strainer | Corning | 07-201-431 | |
| Attune NxT Flow Cytometer | ThermoFisher Scientific | ||
| BALB/C, 6-8 week old | Jackson Laboratory | 651 | |
| B-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | |
| Bovine Serum Albumin | GOLDBIO | A-420-500 | |
| DMEM Medium | Gibco | 11965092 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS), without Calcium and Magnesium | Gibco | 14-190-250 | |
| DynaMag-2 Magnet | Invitrogen | 12-321-D | |
| EasySep Magnet | Stemcell Technologies | 18000 | |
| EasySep Mouse T cell Isolation Kit | Stemcell Technologies | 19851 | |
| FACS buffer | BD | BDB554657 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Corning | MT35011CV | |
| GlutaMAX | Gibco | 35-050-061 | |
| G-Rex6 | Wilson Wolf | 80240M | |
| HEPES Buffer Solution | Gibco | 15-630-080 | |
| Human recombinant IL-15 | Miltenyi Biotec | 130-095-765 | |
| Human recombinant IL-2 | Miltenyi Biotec | 130-097-748 | |
| Human recombinant IL-7 | Miltenyi Biotec | 130-095-363 | |
| Lipofectamine 3000 | Invitrogen | L3000008 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Gibco | 11140-050 | |
| Mouse Anti-CD3 BV421 | Biolegend | 100228 | |
| Mouse Anti-CD3/CD28 Dynabeads | Gibco | 11-453-D | |
| Mouse Anti-CD4 BV605 | BD | 563151 | |
| Mouse Anti-CD44 APC | Biolegend | 103011 | |
| Mouse Anti-CD62L PE-Cy7 | Tonbo | SKU 60-0621-U025 | |
| Mouse Anti-CD8 APC-Cy7 | Tonbo | SKU 25-0081-U025 | |
| Nikon Ti2 with Prime 95B camera | Nikon | ||
| Non-treated 24 well plates | CytoOne | CC7672-7524 | |
| Opti-MEM | Gibco | 31-985-062 | |
| pCL-Eco | Addgene | #12371 | |
| Penicillin/Streptomycin Solution | Gibco | 15-070-063 | |
| Phoenix Eco cells | ATCC | CRL-3214 | |
| pMDG.2 | Addgene | #12259 | |
| pMSCV_PGK_GFP28z | N/A | Produced by R.LV. | |
| Purified sfGFP | N/A | Produced by R.LV. | |
| RetroNectin ('transduction reagent') | Takara Bio | T100B | |
| RPMI 1640 | Gibco | 21875 | |
| Serological pipette 10 mL | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
| Serological pipette 25 mL | Fisher Scientific | 13-678-11 | |
| Serological pipette 5 mL | Fisher Scientific | 13-678-11D | |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11-360-070 | |
| TC-treated 24 well plates | Corning | 08-772-1 | |
| Trypan blue | Gibco | 15-250-061 |
Riferimenti
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