从成年小鼠脊髓中分离纯星形胶质细胞和小胶质细胞，用于 体外 测定和转录组学研究
Summary
该方案概述了从成年小鼠脊髓中分离纯化的星形胶质细胞和小胶质细胞，促进了后续应用，如RNA分析和细胞培养。它包括详细的细胞解离方法和程序，旨在提高分离细胞的质量和产量。
Abstract
星形胶质细胞和小胶质细胞在中枢神经系统发育、损伤反应和神经退行性疾病中起着关键作用。这些高度动态的细胞表现出对环境变化的快速反应，并在形态、转录谱和功能方面表现出显着的异质性。虽然我们对神经胶质细胞在健康和疾病中的功能的理解已经有了很大的进步，但仍然需要在损伤或损伤的背景下进行 体外细胞特异性分析，以全面表征不同的细胞群。与细胞系或新生动物相比，从成年小鼠中分离细胞具有多项优势，因为它允许在病理条件下和特定时间点分析细胞。此外，专注于脊髓特异性分离（不包括脑部受累）可以研究脊髓病理学，包括实验性自身免疫性脑脊髓炎、脊髓损伤和肌萎缩侧索硬化症。该方案提供了一种从成年小鼠脊髓中分离星形胶质细胞和小胶质细胞的有效方法，有助于立即或将来的分析，并在功能，分子或蛋白质组学下游研究中具有潜在应用。
Introduction
星形胶质细胞和小胶质细胞是多功能神经胶质细胞，在中枢神经系统 （CNS） 中起着至关重要的作用，包括调节神经元功能、促进中枢神经系统发育、维持血脑屏障以及参与其他关键过程等职责 1,2,3,4.除了在维持体内平衡方面的作用外，这些神经胶质细胞在损伤和修复机制中也起着关键作用。小胶质细胞以其吞噬、炎症和损伤后的迁移能力而闻名 5,6,7。疾病中的星形胶质细胞反应同样多种多样，包括炎症、神经胶质瘢痕的形成和血脑屏障的损害 8,9。尽管我们对小胶质细胞和星形胶质细胞在中枢神经系统中的有害和修复作用的理解有所增长，但它们的结构和功能固有的异质性需要强大的工具来研究它们在各种情况下。
进一步了解小胶质细胞和星形胶质细胞在健康和疾病中的作用需要 体内 和 体外 研究的综合方法。 体内 技术利用神经胶质细胞和中枢神经系统内神经元之间错综复杂的串扰，而 体外 方法在评估特定刺激下的单细胞功能或反应时被证明是有价值的。每种方法都有独特的优势; 体外 研究对于了解这些细胞类型的特定作用至关重要，而无需来自邻近细胞的直接或间接输入。此外，利用永生细胞系的 体外 检测具有某些好处，包括无限增殖的能力、成本效益和易于维护。然而，重要的是要注意，与细胞系相比，原代细胞更接近地模仿正常的生理反应。这种生理相关性在功能测定和转录组学分析中至关重要。
获得原代细胞，特别是从成年小鼠脊髓中获取原代细胞的挑战之一在于样本的数量和活力。成人脊髓比大脑小，含有大量的髓鞘，这带来了独特的困难。虽然有几种已发表的方案详细说明了从新生动物或成年小鼠大脑中分离纯、活的神经胶质细胞10,11,12,13，但这些方法可能不适合研究脊髓特异性的疾病和损伤。在该方案中，我们提供了一个全面的程序，可以有效地从成年小鼠脊髓中分离纯、活的小胶质细胞和星形胶质细胞，促进细胞培养和转录组学分析的下游应用。该方案已成功用于从10周至5个月的成年小鼠中分离这些细胞，证明了其在各种情况下的实用性，包括涉及条件敲除小鼠的研究，药物反应，发育研究和年龄相关模型。
Protocol
Representative Results
Discussion
分离纯活的原代细胞对于研究特定细胞类型的结构和功能至关重要。在成年小鼠中，特别是在脊髓中，这项任务带来了重大挑战，因为现有的方案通常不是针对成年脊髓量身定制的10,17。该方案提供了一种高效且具有成本效益的方法，适用于各种下游应用，包括细胞培养、流式细胞术、组织学和转录组学研究。
脊髓制备的速度在确?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢乔治华盛顿大学基因组学核心的 Castle Raley 进行 RNA 分析，并感谢 Q2 Lab Solutions 的 RNA 测序分析。这项工作得到了美国国家神经疾病和中风研究所[资助号F31NS117085]和Vivian Gill研究基金会对Robert H. Miller博士的支持。 图 1 是使用 BioRender.com 创建的。
Materials
| 2,2,2-Tribromoethanol | Sigma Aldrich | T48402 | |
| 24 well tissue culture plate | Avantor | 10861-558 | |
| 2-Methyl-2-butanol, 98% | Thermo Fisher | A18304-0F | |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride | Invitrogen | D1306 | 1:1000 |
| 45% glucose solution | Corning | 25-037-CI | |
| 5 mL capped tubes | Eppendorf | 30122305 | |
| Acetic acid | Sigma-Adlrich | A6283 | |
| Adult Brain Dissociation Kit | Miltenyi | 103-107-677 | |
| Anti-ACSA2 Microbead Kit | Miltenyi | 130-097-679 | |
| Anti-Iba1 | Wako | 019-1974 | |
| Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939BA | |
| C57BL/6J wild-type (WT) mice | Jackson Laboratories | ||
| CD11b (Microglia) MicroBeads | Miltenyi | 130-093-634 | |
| Celltrics 30 µm filter | Sysmex Partec | 04-004-2326 | |
| Counting Chamber (Hemacytometer) | Hausser Scientific Co | 3200 | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma Aldrich | D4527-40KU | |
| Distilled water | TMO | 15230001 | |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher | 11320074 | |
| DNase for RNA purification | Qiagen | 79254 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | Thermo Fisher | 14040117 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher | A5209401 | |
| GFAP antibody (mouse) | Santa Cruz | sc-33673 | 1:500 |
| GFAP antibody (rabbit) | Dako | Z0334 | 1:500 |
| Goat anti-mouse 594 IgG | Invitrogen | a11032 | 1:500 |
| Goat anti-mouse 594 IgM | Invitrogen | a21044 | 1:300 |
| Goat anti-Rabbit 488 IgG | Invitrogen | a11008 | 1:500 |
| Iba1 antibody (rabbit) | Wako | 019-1974 | 1:500 |
| MACS Separator | Miltenyi | 130-042-303 | |
| Masterflex C/L Pump System | Thermo Fisher | 77122-22 | |
| MEM | Corning | 15-015-CV | |
| Methanol | Sigma-Adlrich | 439193 | |
| Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000-10 | |
| MS Columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| O4 Antibody | R&D | MAB1326 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070063 | |
| Plugged 9" glass pasteur pipette | VWR | 14672-412 | |
| RNeasy Plus Micro Kit | Qiagen | 74034 | |
| Royal-tek Surgical scalpel blade no. 10 | Fisher scientific | 22-079-683 | |
| Small Vein Infusion Set, 23 G x 19 mm | Kawasumi | D3K2-23G |
Riferimenti
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