Isolation of Pure Astrocytes and Microglia from the Adult Mouse Spinal Cord For In Vitro Assays and Transcriptomic Studies( 체외 분석 및 전사체 연구를 위한 성인 마우스 척수에서 순수 성상교세포 및 미세아교세포의 분리)
Summary
이 프로토콜은 성체 마우스 척수에서 정제된 성상교세포와 미세아교세포를 분리하여 RNA 분석 및 세포 배양과 같은 후속 응용 분야를 용이하게 합니다. 여기에는 분리된 세포의 품질과 수율을 모두 향상시키기 위해 고안된 상세한 세포 해리 방법 및 절차가 포함됩니다.
Abstract
성상교세포와 미세아교세포는 중추신경계 발달, 부상 반응 및 신경퇴행성 질환에 중추적인 역할을 합니다. 이러한 매우 역동적인 세포는 환경 변화에 빠르게 반응하며 형태학, 전사 프로파일 및 기능 측면에서 상당한 이질성을 나타냅니다. 건강과 질병에서 신경교세포의 기능에 대한 우리의 이해가 크게 발전했지만, 뚜렷한 세포 집단을 포괄적으로 특성화하기 위해 모욕 또는 부상의 맥락에서 수행된 체외 세포 특이적 분석의 필요성은 여전히 남아 있습니다. 성체 마우스에서 세포를 분리하면 병리학적 조건 및 특정 시점에서의 세포 분석이 가능하기 때문에 세포주 또는 신생아 동물에 비해 여러 가지 이점이 있습니다. 또한 뇌 침범을 제외한 척수 특이적 분리에 초점을 맞추면 실험적 자가면역 뇌척수염, 척수 손상 및 근위축성 측삭 경화증을 포함한 척수 병리학에 대한 연구가 가능합니다. 이 프로토콜은 성체 마우스 척수에서 성상교세포와 미세아교세포를 분리하기 위한 효율적인 방법을 제시하여 기능적, 분자적 또는 단백질체 다운스트림 연구에서 잠재적인 응용 분야를 통해 즉각적인 또는 향후 분석을 용이하게 합니다.
Introduction
성상교세포(astrocyte)와 미세아교세포(microglia)는 중추신경계(CNS)에서 중요한 역할을 하는 다재다능한 신경교세포로, 신경 기능 조절, 중추신경계 발달에 기여, 혈액뇌장벽 유지, 기타 중요한 과정 참여 등의 역할을 포함합니다 1,2,3,4 . 항상성을 유지하는 역할 외에도 이 신경교세포는 부상 및 복구 메커니즘에서 중추적인 역할을 합니다. 미세아교세포(Microglia)는 모욕이나 부상 후 식세포, 염증 및 이동 능력으로 잘 알려져 있다 5,6,7. 질병에서 성상교세포의 반응은 염증, 신경교세포의 형성, 혈액뇌장벽의 손상에 대한 기여를 포함하여 똑같이 다양합니다 8,9. 중추신경계에서 미세아교세포와 성상교세포의 해로운 역할과 회복 역할에 대한 이해가 높아졌지만, 구조와 기능 모두에 내재된 이질성으로 인해 다양한 맥락에서 이를 연구하기 위한 강력한 도구가 필요합니다.
건강과 질병에서 미세아교세포와 성상교세포의 역할에 대한 더 깊은 통찰력을 얻으려면 in vivo 및 in vitro 조사의 결합된 접근 방식이 필요합니다. In vivo 기술은 중추신경계 내의 신경교세포와 뉴런 사이의 복잡한 누화를 활용하는 반면, in vitro 방법론은 특정 자극에 대한 단일 세포 기능 또는 반응을 평가할 때 가치가 있는 것으로 입증되었습니다. 각 방법은 고유한 이점을 제공합니다. In vitro 연구는 인접 세포의 직간접적인 입력 없이 이러한 세포 유형의 특정 역할을 이해하는 데 필수적입니다. 또한 불멸 세포주를 활용한 in vitro 분석은 무한정 증식할 수 있는 능력, 비용 효율성 및 유지 관리 용이성을 포함한 특정 이점을 제공합니다. 그러나 일차 세포는 세포주에 비해 정상적인 생리적 반응을 더 가깝게 모방한다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 이러한 생리학적 관련성은 기능적 분석 및 전사체 분석에서 매우 중요합니다.
특히 성체 쥐 척수에서 일차 세포를 얻는 데 있어 어려운 점 중 하나는 샘플의 양과 생존력에 있습니다. 성인 척수는 뇌보다 작고 상당한 양의 미엘린을 함유하고 있기 때문에 독특한 어려움을 겪고 있습니다. 신생아 동물 또는 성체 마우스 뇌10,11,12,13에서 순수하고 생존 가능한 신경교세포를 분리하는 것을 상세히 설명하는 몇 가지 발표된 프로토콜이 있지만, 이러한 방법론은 척수에 특이적인 질병 및 부상을 연구하는 데 적합하지 않을 수 있습니다. 이 프로토콜에서는 성체 마우스 척수에서 순수하고 생존 가능한 미세아교세포와 성상교세포를 효율적으로 분리하여 세포 배양 및 전사체 분석의 다운스트림 응용을 용이하게 하는 포괄적인 절차를 제공합니다. 이 프로토콜은 10주에서 5개월 사이의 성체 마우스에서 이러한 세포를 분리하는 데 성공적으로 사용되었으며, 조건부 녹아웃 마우스, 약물 반응, 발달 연구 및 연령 관련 모델과 관련된 연구를 포함하여 다양한 맥락에서 유용성을 입증했습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
순수하고 생존 가능한 일차 세포의 분리는 특정 세포 유형의 구조와 기능을 조사하는 데 가장 중요합니다. 성체 마우스에서, 특히 척수에서, 이 작업은 현존하는 프로토콜이 종종 성체 척수에 맞추어지지 않기 때문에 상당한 도전을 제기한다(10,17). 이 프로토콜은 세포 배양, 유세포 분석, 조직학 및 전사체 연구를 포함한 다양한 다운스트림 응용 분야에…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
RNA 분석을 위한 George Washington University Genomics Core와 RNA 염기서열 분석을 위한 Q2 Lab Solutions의 Castle Raley에게 감사드립니다. 이 연구는 국립 신경 장애 및 뇌졸중 연구소(National Institute of Neurological Disorders and Stroke)[보조금 번호 F31NS117085]와 로버트 H. 밀러 박사(Dr. Robert H. Miller)의 비비안 길 연구 기금(Vivian Gill Research Endowment)의 지원을 받았습니다. 그림 1 은 BioRender.com 사용하여 만들었습니다.
Materials
| 2,2,2-Tribromoethanol | Sigma Aldrich | T48402 | |
| 24 well tissue culture plate | Avantor | 10861-558 | |
| 2-Methyl-2-butanol, 98% | Thermo Fisher | A18304-0F | |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride | Invitrogen | D1306 | 1:1000 |
| 45% glucose solution | Corning | 25-037-CI | |
| 5 mL capped tubes | Eppendorf | 30122305 | |
| Acetic acid | Sigma-Adlrich | A6283 | |
| Adult Brain Dissociation Kit | Miltenyi | 103-107-677 | |
| Anti-ACSA2 Microbead Kit | Miltenyi | 130-097-679 | |
| Anti-Iba1 | Wako | 019-1974 | |
| Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939BA | |
| C57BL/6J wild-type (WT) mice | Jackson Laboratories | ||
| CD11b (Microglia) MicroBeads | Miltenyi | 130-093-634 | |
| Celltrics 30 µm filter | Sysmex Partec | 04-004-2326 | |
| Counting Chamber (Hemacytometer) | Hausser Scientific Co | 3200 | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma Aldrich | D4527-40KU | |
| Distilled water | TMO | 15230001 | |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher | 11320074 | |
| DNase for RNA purification | Qiagen | 79254 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | Thermo Fisher | 14040117 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher | A5209401 | |
| GFAP antibody (mouse) | Santa Cruz | sc-33673 | 1:500 |
| GFAP antibody (rabbit) | Dako | Z0334 | 1:500 |
| Goat anti-mouse 594 IgG | Invitrogen | a11032 | 1:500 |
| Goat anti-mouse 594 IgM | Invitrogen | a21044 | 1:300 |
| Goat anti-Rabbit 488 IgG | Invitrogen | a11008 | 1:500 |
| Iba1 antibody (rabbit) | Wako | 019-1974 | 1:500 |
| MACS Separator | Miltenyi | 130-042-303 | |
| Masterflex C/L Pump System | Thermo Fisher | 77122-22 | |
| MEM | Corning | 15-015-CV | |
| Methanol | Sigma-Adlrich | 439193 | |
| Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000-10 | |
| MS Columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| O4 Antibody | R&D | MAB1326 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070063 | |
| Plugged 9" glass pasteur pipette | VWR | 14672-412 | |
| RNeasy Plus Micro Kit | Qiagen | 74034 | |
| Royal-tek Surgical scalpel blade no. 10 | Fisher scientific | 22-079-683 | |
| Small Vein Infusion Set, 23 G x 19 mm | Kawasumi | D3K2-23G |
Riferimenti
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