Isolering av rena astrocyter och mikroglia från ryggmärgen hos vuxna möss för in vitro-analyser och transkriptomiska studier
Summary
Detta protokoll beskriver isoleringen av renade astrocyter och mikroglia från den vuxna musens ryggmärg, vilket underlättar efterföljande tillämpningar som RNA-analys och cellodling. Den innehåller detaljerade metoder och procedurer för celldissociation som är utformade för att förbättra både kvaliteten och utbytet av isolerade celler.
Abstract
Astrocyter och mikroglia spelar centrala roller i utvecklingen av centrala nervsystemet, skadereaktioner och neurodegenerativa sjukdomar. Dessa mycket dynamiska celler uppvisar snabba reaktioner på miljöförändringar och uppvisar betydande heterogenitet när det gäller morfologi, transkriptionsprofiler och funktioner. Även om vår förståelse av gliacellernas funktioner vid hälsa och sjukdom har utvecklats avsevärt, finns det fortfarande ett behov av in vitro, cellspecifika analyser som utförs i samband med förolämpningar eller skador för att på ett heltäckande sätt karakterisera distinkta cellpopulationer. Att isolera celler från den vuxna musen erbjuder flera fördelar jämfört med cellinjer eller neonatala djur, eftersom det möjliggör analys av celler under patologiska förhållanden och vid specifika tidpunkter. Att fokusera på ryggmärgsspecifik isolering, exklusive hjärnengagemang, möjliggör forskning om ryggmärgspatologier, inklusive experimentell autoimmun encefalomyelit, ryggmärgsskada och amyotrofisk lateralskleros. Detta protokoll presenterar en effektiv metod för att isolera astrocyter och mikroglia från ryggmärgen hos vuxna möss, vilket underlättar omedelbar eller framtida analys med potentiella tillämpningar i funktionella, molekylära eller proteomiska nedströmsstudier.
Introduction
Astrocyter och mikroglia är mångsidiga gliaceller som spelar viktiga roller i det centrala nervsystemet (CNS) och omfattar ansvar som att reglera neuronal funktion, bidra till CNS-utveckling, upprätthålla blod-hjärnbarriären och delta i andra kritiska processer 1,2,3,4 . Förutom sin roll i att upprätthålla homeostas spelar dessa gliaceller också en central roll i skade- och reparationsmekanismer. Mikroglia är välkända för sin fagocytiska, inflammatoriska och migrerande förmåga efter förolämpningar eller skador 5,6,7. Astrocytresponsen vid sjukdom är lika varierande, och omfattar bidrag till inflammation, bildandet av gliaärr och kompromettering av blod-hjärnbarriären 8,9. Även om vår förståelse för mikroglias och astrocyters skadliga och reparativa roller i CNS har ökat, kräver den inneboende heterogeniteten i både deras struktur och funktion robusta verktyg för att studera dem i olika sammanhang.
För att få ytterligare insikt i mikroglias och astrocyters roll i hälsa och sjukdom krävs ett kombinerat tillvägagångssätt med in vivo – och in vitro-undersökningar . In vivo-tekniker utnyttjar den intrikata överhörningen mellan gliaceller och neuroner inom CNS, medan in vitro-metoder visar sig vara värdefulla vid bedömning av encellsfunktioner eller svar under specifika stimuli. Varje metod erbjuder unika fördelar; In vitro-studier är viktiga för att förstå de specifika rollerna för dessa celltyper utan direkt eller indirekt input från närliggande celler. Dessutom ger in vitro-analyser som använder odödliga cellinjer vissa fördelar, inklusive förmågan att föröka sig på obestämd tid, kostnadseffektivitet och enkelt underhåll. Det är dock viktigt att notera att primära celler mer efterliknar normala fysiologiska svar jämfört med cellinjer. Denna fysiologiska relevans är avgörande i funktionella analyser och transkriptomiska analyser.
En av utmaningarna med att få fram primära celler, särskilt från ryggmärgen hos vuxna möss, ligger i provernas kvantitet och livsduglighet. Den vuxna ryggmärgen, som är mindre än hjärnan och innehåller en betydande mängd myelin, utgör unika svårigheter. Även om det finns flera publicerade protokoll som beskriver isoleringen av rena, livskraftiga gliaceller från neonatala djur eller den vuxna mushjärnan 10,11,12,13, kanske dessa metoder inte är lämpliga för att studera sjukdomar och skador som är specifika för ryggmärgen. I detta protokoll erbjuder vi en omfattande procedur för att effektivt isolera rena, livskraftiga mikroglia och astrocyter från den vuxna musens ryggmärg, vilket underlättar nedströmsapplikationer i cellodling och transkriptomiska analyser. Detta protokoll har framgångsrikt använts för att isolera dessa celler från vuxna möss i åldern 10 veckor till 5 månader, vilket visar dess användbarhet i olika sammanhang, inklusive studier som involverar villkorliga knockout-möss, läkemedelssvar, utvecklingsforskning och åldersrelaterade modeller.
Protocol
Representative Results
Discussion
Isoleringen av rena, livskraftiga primära celler är av största vikt för att undersöka strukturen och funktionen hos specifika celltyper. Hos vuxna möss, särskilt i ryggmärgen, innebär denna uppgift betydande utmaningar, eftersom befintliga protokoll ofta inte är anpassade till den vuxna ryggmärgen10,17. Detta protokoll presenterar en effektiv och kostnadseffektiv metod som är tillämplig på olika nedströmsapplikationer, inklusive cellodling, flödes…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Castle Raley vid George Washington University Genomics Core för RNA-analyser och Q2 Lab Solutions för RNA-sekvenseringsanalyser. Detta arbete stöddes av National Institute of Neurological Disorders and Stroke [anslag nummer F31NS117085] och Vivian Gill Research Endowment till Dr. Robert H. Miller. Figur 1 skapades med BioRender.com.
Materials
| 2,2,2-Tribromoethanol | Sigma Aldrich | T48402 | |
| 24 well tissue culture plate | Avantor | 10861-558 | |
| 2-Methyl-2-butanol, 98% | Thermo Fisher | A18304-0F | |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride | Invitrogen | D1306 | 1:1000 |
| 45% glucose solution | Corning | 25-037-CI | |
| 5 mL capped tubes | Eppendorf | 30122305 | |
| Acetic acid | Sigma-Adlrich | A6283 | |
| Adult Brain Dissociation Kit | Miltenyi | 103-107-677 | |
| Anti-ACSA2 Microbead Kit | Miltenyi | 130-097-679 | |
| Anti-Iba1 | Wako | 019-1974 | |
| Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939BA | |
| C57BL/6J wild-type (WT) mice | Jackson Laboratories | ||
| CD11b (Microglia) MicroBeads | Miltenyi | 130-093-634 | |
| Celltrics 30 µm filter | Sysmex Partec | 04-004-2326 | |
| Counting Chamber (Hemacytometer) | Hausser Scientific Co | 3200 | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma Aldrich | D4527-40KU | |
| Distilled water | TMO | 15230001 | |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher | 11320074 | |
| DNase for RNA purification | Qiagen | 79254 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | Thermo Fisher | 14040117 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher | A5209401 | |
| GFAP antibody (mouse) | Santa Cruz | sc-33673 | 1:500 |
| GFAP antibody (rabbit) | Dako | Z0334 | 1:500 |
| Goat anti-mouse 594 IgG | Invitrogen | a11032 | 1:500 |
| Goat anti-mouse 594 IgM | Invitrogen | a21044 | 1:300 |
| Goat anti-Rabbit 488 IgG | Invitrogen | a11008 | 1:500 |
| Iba1 antibody (rabbit) | Wako | 019-1974 | 1:500 |
| MACS Separator | Miltenyi | 130-042-303 | |
| Masterflex C/L Pump System | Thermo Fisher | 77122-22 | |
| MEM | Corning | 15-015-CV | |
| Methanol | Sigma-Adlrich | 439193 | |
| Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000-10 | |
| MS Columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| O4 Antibody | R&D | MAB1326 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070063 | |
| Plugged 9" glass pasteur pipette | VWR | 14672-412 | |
| RNeasy Plus Micro Kit | Qiagen | 74034 | |
| Royal-tek Surgical scalpel blade no. 10 | Fisher scientific | 22-079-683 | |
| Small Vein Infusion Set, 23 G x 19 mm | Kawasumi | D3K2-23G |
Riferimenti
- Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nat Rev Neurosci. 7, 41-53 (2006).
- Heithoff, B. P., et al. Astrocytes are necessary for blood-brain barrier maintenance in the adult mouse brain. Glia. 69 (2), 436-472 (2021).
- Badimon, A., et al. Negative feedback control of neuronal activity by microglia. Nature. 586, 417-423 (2020).
- Yanuck, S. F. Microglial phagocytosis of neurons: diminishing neuronal loss in traumatic, infectious, inflammatory, and autoimmune CNS disorders. Front Psychiatry. 10, 712 (2019).
- Xu, Y. J., Au, N. P. B., Ma, C. H. E. Functional and phenotypic diversity of microglia: implication for microglia-based therapies for alzheimer’s disease. Front Aging Neurosci. 14, 896852 (2022).
- Song, S., et al. Microglial-oligodendrocyte interactions in myelination and neurological function recovery after traumatic brain injury. J Neuroinflammation. 19 (1), 246 (2022).
- Butler, C. A., et al. Microglial phagocytosis of neurons in neurodegeneration, and its regulation. J Neurochem. 158 (3), 621-639 (2021).
- Voskuhl, R. R., et al. Reactive astrocytes form scar-like perivascular barriers to leukocytes during adaptive immune inflammation of the CNS. J Neurosci. 29 (37), 11511-11522 (2009).
- Bordon, Y. MAFG activity in astrocytes drives CNS inflammation. Nature Reviews Immunology. 20, 205 (2020).
- Agalave, N. M., Lane, B. T., Mody, P. H., Szabo-Pardi, T. A., Burton, M. D. Isolation, culture, and downstream characterization of primary microglia and astrocytes from adult rodent brain and spinal cord. J Neurosci Methods. 340, 108742 (2020).
- Kerstetter, A. E., Miller, R. H. Isolation and culture of spinal cord astrocytes. Methods in Molecular Biology. 814, 93-104 (2012).
- Hersbach, B. A., Simon, T., Masserdotti, G. Isolation and direct neuronal reprogramming of mouse astrocytes. J Vis Exp. (185), 64175 (2022).
- Nikodemova, M., Watters, J. J. Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain. J Neuroinflammation. 9, 147 (2012).
- Richner, M., Jager, S. B., Siupka, P., Vaegter, C. B. Hydraulic extrusion of the spinal cord and isolation of dorsal root ganglia in rodents. J Vis Exp. (119), e55226 (2017).
- Davies, J., Denyer, T., Hadfield, J. Bioanalyzer chips can be used interchangeably for many analyses of DNA or RNA. Biotechniques. 60 (4), 197-199 (2016).
- Ahn, J. J., Islam, Y., Miller, R. H. Cell type specific isolation of primary astrocytes and microglia from adult mouse spinal cord. J Neurosci Methods. 375, 109599 (2022).
- Pan, J., Wan, J. Methodological comparison of FACS and MACS isolation of enriched microglia and astrocytes from mouse brain. J Immunol Methods. 486, 112834 (2020).
- Neuschulz, A., et al. A single-cell RNA labeling strategy for measuring stress response upon tissue dissociation. Mol Syst Biol. 19, 11147 (2023).
- CB, S., et al. One brain-all cells: a comprehensive protocol to isolate all principal cns-resident cell types from brain and spinal cord of adult healthy and EAE mice. Cells. 10 (3), 1-25 (2021).
