تشوه كهربائي معدل السعة لتقييم التعب الميكانيكي للخلايا البيولوجية
Summary
يظهر هنا بروتوكول لاختبار التعب الميكانيكي في حالة خلايا الدم الحمراء البشرية باستخدام نهج التشوه الكهربائي المعدل السعة. يمكن استخدام هذا النهج العام لقياس التغيرات المنهجية في الخصائص المورفولوجية والميكانيكية الحيوية للخلايا البيولوجية في تعليق من التشوه الدوري.
Abstract
تشتهر خلايا الدم الحمراء (كرات الدم الحمراء) بتشوهها الملحوظ. يتعرضون مرارا وتكرارا لتشوه كبير عند المرور عبر دوران الأوعية الدقيقة. يظهر انخفاض التشوه في كرات الدم الحمراء المسنة من الناحية الفسيولوجية. لا يمكن بسهولة استخدام التقنيات الحالية لقياس تشوه الخلايا لقياس التعب ، والتدهور التدريجي في أغشية الخلايا الناجم عن الأحمال الدورية. نقدم بروتوكولا لتقييم التدهور الميكانيكي في كرات الدم الحمراء من إجهادات القص الدورية باستخدام التشوه الكهربائي القائم على تعديل مفتاح إزاحة السعة (ASK) في قناة الموائع الدقيقة. باختصار ، يتم إثارة الأقطاب الكهربائية المتداخلة في قناة الموائع الدقيقة بتيار متناوب منخفض الجهد عند ترددات الراديو باستخدام مولد إشارة. تستجيب كرات الدم الحمراء المعلقة للمجال الكهربائي وتظهر رحلان كهربائي إيجابي (DEP) ، والذي ينقل الخلايا إلى حواف القطب. ثم تتمدد الخلايا بسبب القوى الكهربائية التي تمارس على نصفي الخليتين ، مما يؤدي إلى تمدد أحادي المحور ، يعرف باسم التشوه الكهربائي. يمكن تعديل مستوى إجهاد القص والتشوه الناتج بسهولة عن طريق تغيير سعة موجة الإثارة. وهذا يتيح تحديد كميات التشوه غير الخطي لكرات الدم الحمراء استجابة للتشوهات الصغيرة والكبيرة عند الإنتاجية العالية. يؤدي تعديل موجة الإثارة باستخدام إستراتيجية ASK إلى حدوث تشوه كهربائي دوري بمعدلات تحميل وترددات قابلة للبرمجة. هذا يوفر طريقة مريحة لتوصيف التعب كرات الدم الحمراء. يتيح نهج التشوه الكهربائي المعدل ASK الخاص بنا ، لأول مرة ، قياسا مباشرا لإجهاد كرات الدم الحمراء من الأحمال الدورية. يمكن استخدامه كأداة للاختبار الميكانيكي الحيوي العام ، لتحليل تشوه الخلايا والتعب في أنواع الخلايا الأخرى والظروف المرضية ، ويمكن أيضا دمجه مع استراتيجيات للتحكم في البيئة المكروية للخلايا ، مثل توتر الأكسجين والإشارات البيولوجية والكيميائية.
Introduction
خلايا الدم الحمراء (كرات الدم الحمراء) هي أكثر الخلايا تشوها في جسم الإنسان1. ترتبط قابليتها للتشوه ارتباطا مباشرا بوظائفها في حمل الأكسجين. تم العثور على انخفاض التشوه في كرات الدم الحمراء ليرتبط مع التسبب في العديد من اضطرابات كرات الدمالحمراء 2. قادتنا قياسات التشوه إلى فهم أفضل للأمراض المرتبطة بكرات الدم الحمراء3. يمكن أن يختلف العمر الطبيعي لكرات الدم الحمراء من 70 إلى 140 يوما4. لذلك ، من المهم قياس كيفية انخفاض قابليتها للتشوه جنبا إلى جنب مع عملية الشيخوخة ، على سبيل المثال ، سلوك التعب بسبب إجهادات القص الدورية3.
يعد قياس تشوه كرات الدم الحمراء عند الإنتاجية العالية أمرا صعبا بسبب قوى مقياس piconewton (~ 10-12 N) التي يتم تطبيقها على الخلايا الفردية. على مدى العقد الماضي ، تم تطوير العديد من التقنيات لقياس تشوه الخلايا5. يمكن إجراء قياسات تشوه كرات الدم الحمراء على مستوى الخلية الواحدة عن طريق شفط الماصة والملاقط البصرية ، بينما يتم إجراء التحليلات السائبة عن طريق قياس التدرج التناضحي. توفر تحليلات قياس كتكتاوات الدم وفرة من البيانات ، مما يوفر فرصة لتشخيص اضطرابات الدم 6,7. يمكن أيضا تحليل تشوه كرات الدم الحمراء باستخدام نظرية المرونة اللزجة بواسطة مجهر القوة الذرية للمسبار الغرواني. في هذه الطريقة ، يتم تطبيق التحليل الحسابي لتقدير معامل المرونة لكرات الدم الحمراء ، مع الأخذ في الاعتبار كل من الاستجابات المعتمدة على الوقت والحالة المستقرة. يمكن قياس تشوه كرات الدم الحمراء الفردية باستخدام طريقة صفيف الغرفة الدقيقة أحادية الخلية. تحلل هذه الطريقة كل خلية من خلال الغشاء وعلامات الفلورسنت الخلوية لتوفير معلومات عن تشوه كرات الدم الحمراء وتوزيع الخصائص الخلوية في مجموعات كرات الدم الحمراء المعقدة للكشف عن الاضطرابات الدموية8.
التعب هو عامل رئيسي في تدهور خصائص المواد الهندسية والمواد الحيوية. يتيح اختبار التعب إجراء تحليل كمي لسلامة وطول عمر الهيكل المعرض للتحميل الدوري. لطالما تم إعاقة تحليل التعب في الخلايا البيولوجية بسبب عدم وجود طريقة عامة وقابلة للتطبيق بسهولة وإنتاجية عالية وكمية لتنفيذ التشوه الدوري في أغشية الخلايا. هذا ممكن مع استخدام تعديل الإشارة الكهربائية وتقنيات التشوه الكهربائي المنفذة في بيئة الموائع الدقيقة. يتم تطبيق تقنية مفتاح إزاحة السعة (ASK) كتعديل رقمي من خلال تعديل مفتاح On-Off (OOK) في هذه المقالة. يشير مفهوم المفاتيح إلى إرسال الإشارات الرقمية عبر القناة ، الأمر الذي يتطلب إشارة حاملة موجة جيبية لتعمل9. يمكن ضبط أوقات التشغيل والإيقاف على قدم المساواة. تحت ON-keying ، تدخل كرات الدم الحمراء في حالة مشوهة أثناء تعرضها لقوة تشوه كهربائي خارجي (Fdep) 10 تم إنشاؤها بواسطة المجال الكهربائي غير المنتظم. تحت OFF-keying ، تكون كرات الدم الحمراء في حالة استرخاء. نلاحظ إجهاد كرات الدم الحمراء ، أي التدهور التدريجي في قدرتها على التمدد مع زيادة دورات التحميل. يمكن أن يوفر فقدان التشوه الناجم عن التعب في كرات الدم الحمراء نظرة ثاقبة على تلف الغشاء المتراكم أثناء الدورة الدموية ، مما يمكننا من إجراء مزيد من التحقيق في الروابط بين إجهاد الخلايا وحالات المرض.
نقدم هنا إجراءات خطوة بخطوة حول كيفية تنفيذ اختبار التعب لكرات الدم الحمراء في جهاز الموائع الدقيقة عبر التشوه الكهربائي المعدل ASK وإعدادات النظام مثل جهاز الموائع الدقيقة ، والتحميل الميكانيكي ، والتخيل المجهري لتوصيف التدهور التدريجي في التشوه الميكانيكي لكرات الدم الحمراء.
Protocol
Representative Results
Discussion
يمكن استخدام تعديل ASK OOK لموجة جيبية تحفز قوة DEP لاختبار التعب الميكانيكي لكرات الدم الحمراء على مدى فترة طويلة من الزمن. في هذا البروتوكول ، قصرنا اختبار التعب في المختبر على 1 ساعة لمنع الآثار الأيضية الضارة المحتملة على تشوه الخلية. يمكن برمجة ظروف اختبار التعب الشاملة باستخدام تقنية الت…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذا البحث من قبل NSF / CMMI Mechanobiology لناقلات الأكسجين الاصطناعي القائمة على الهيموجلوبين (# 1941655) و NSF / CMMI التحليل الديناميكي والتعب لخلايا الدم الحمراء الصحية والمريضة (# 1635312).
Materials
| Balance Scale | ViBRA | HT-224R | |
| Bandpass filter | BRIGHTLINE | 414/46 BrightLine HC | |
| BD Disposable Syringes with Luer-Lok™ Tips, 1 mL | Fisher Scientific | 14-823-30 | |
| Biopsy Punches with Plunger System, 1.5 mm | Fisher Scientific | 12-460-403 | |
| Biopsy Punches with Plunger System, 3 mm | Fisher Scientific | 12-460-407 | 1.5 mm and 3 mm diameter |
| Blunt needle, 23-gauge | BSTEAN | X001308N97 | |
| Bovin Serum Albumin | RMBIO | BSA-BSH | |
| Centrifuge | SCILOGEX | 911015119999 | |
| Conical Tube, 50 mL | Fisher Scientific | 05-539-13 | |
| Dextrose | Fisher Scientific | MDX01455 | MilliporeSigma™ |
| EC Low Conductivity meter | ecoTestr | 358/03 | |
| Eppendorf Snap-Cap MicrocentrifugeTubes | www.eppendorf.com | 05-402-25 | |
| Excel | Microsoft | Graph plotting | |
| Function Generator | SIGLENT | SDG830 | |
| Glass/ITO Electrode Substrate | OSSILA | S161 | |
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Inverted Microscope | OLYMPUS | IX81 – SN9E07015 | |
| Lab Oven | QUINCY LAB (QL) | MODEL 30GCE | Digital Model |
| Matlab | MathWorks | Graph plotting | |
| Micro Osmometer – Model 3300 | Advanced Instruments Inc. | S/N: 03050397P | |
| Parafilm Laboratory Wrapping Film | Fisher Scientific | 13-374-12 | |
| Petri dish | FALCON | SKU=351006 | ICSI/Biopsydish 50*9 mm |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | LONZA | 04-479Q | |
| Plasma Cleaner | Harrick plasma PDCOOL | NC0301989 | |
| Solidworks | Dassault Systemes | CAD software | |
| Sucrose | Fisher Scientific | 50-188-2419 | |
| Vacuum Desiccator | SPBEL-ART | F42400-2121 | |
| Wooden spatula | Fisher Scientific | NC0304136 | Tongue Depressors Wood NS 6" |
Riferimenti
- Kim, Y., Kim, K., Park, Y. Measurement techniques for red blood cell deformability: recent advances. Blood Cell—An Overview of Studies in Hematology. 10, 167-194 (2012).
- Safeukui, I., et al. Quantitative assessment of sensing and sequestration of spherocytic erythrocytes by the human spleen. Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 120 (2), 424-430 (2012).
- Naghedi-Baghdar, H., et al. Effect of diet on blood viscosity in healthy humans: a systematic review. Electronic physician. 10 (3), 6563 (2018).
- Franco, R. S. Measurement of red cell lifespan and aging. Transfusion Medicine and Hemotherapy. 39 (5), 302-307 (2012).
- Matthews, K., Lamoureux, E. S., Myrand-Lapierre, M. -. E., Duffy, S. P., Ma, H. Technologies for measuring red blood cell deformability. Lab on a Chip. 22, 1254-1274 (2022).
- Kim, J., Lee, H., Shin, S. Advances in the measurement of red blood cell deformability: A brief review. Journal of Cellular Biotechnology. 1 (1), 63-79 (2015).
- Varga, A., Matrai, A. A., Barath, B., Deak, A., Horvath, L., Nemeth, N. Interspecies diversity of osmotic gradient deformability of red blood cells in human and seven vertebrate animal species. Cells. 11 (8), 1351 (2022).
- Doh, I., Lee, W. C., Cho, Y. -. H., Pisano, A. P., Kuypers, F. A. Deformation measurement of individual cells in large populations using a single-cell microchamber array chip. Applied Physics Letters. 100 (17), 173702 (2012).
- Al Safi, A., Bazuin, B. Toward digital transmitters with amplitude shift keying and quadrature amplitude modulators implementation examples. , 1-7 (2017).
- Zhang, J., Chen, K., Fan, Z. H. Circulating tumor cell isolation and analysis. Advances in Clinical Chemistry. 75, 1-31 (2016).
- Cottet, J., Fabregue, O., Berger, C., Buret, F., Renaud, P., Frénéa-Robin, M. MyDEP: a new computational tool for dielectric modeling of particles and cells. Biophysical Journal. 116 (1), 12-18 (2019).
- Haywood, M. Interpreting the full blood count. InnovAiT. 15 (3), 131-137 (2022).
- Qiang, Y., Liu, J., Dao, M., Suresh, S., Du, E. Mechanical fatigue of human red blood cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (40), 19828-19834 (2019).
- Gharaibeh, B., et al. Isolation of a slowly adhering cell fraction containing stem cells from murine skeletal muscle by the preplate technique. Nature Protocols. 3 (9), 1501-1509 (2008).
- Qiang, Y., Liu, J., Dao, M., Du, E. In vitro assay for single-cell characterization of impaired deformability in red blood cells under recurrent episodes of hypoxia. Lab on a Chip. 21 (18), 3458-3470 (2021).
