调幅电形成评估生物细胞的机械疲劳
Summary
这里介绍的是使用调幅电形成方法对人类红细胞进行机械疲劳测试的方案。这种通用方法可用于测量悬浮液中生物细胞形态和生物力学特性的系统变化。
Abstract
红细胞（RBC）以其显着的变形性而闻名。它们在通过微循环时反复发生相当大的变形。在生理老化的红细胞中可见变形性降低。 现有的测量细胞变形性的技术不容易用于测量疲劳，即由循环负荷引起的细胞膜逐渐退化。我们提出了一种协议，用于在微流体通道中使用基于振幅偏移键控（ASK）调制的电形成来评估循环剪切应力对红细胞的机械降解。简而言之，微流体通道中的叉指电极使用信号发生器以射频的低压交流电激励。悬浮液中的红细胞响应电场并表现出正介电泳（DEP），将细胞移动到电极边缘。然后由于施加在两半电池上的力，细胞被拉伸，导致单轴拉伸，称为电形成。通过改变激励波的振幅，可以很容易地调整剪切应力的水平和由此产生的变形。这样就可以量化红细胞的非线性变形性，以响应高通量下的小变形和大变形。使用ASK策略修改激励波可诱导具有可编程负载速率和频率的循环电形成。这为表征红细胞疲劳提供了一种方便的方法。我们的ASK调制电形成方法首次能够直接测量循环载荷引起的红细胞疲劳。它可以用作一般生物力学测试的工具，用于分析其他细胞类型和患病条件下的细胞变形性和疲劳，也可以与控制细胞微环境的策略相结合，例如氧张力和生物和化学线索。
Introduction
红细胞（RBC）是人体中最易变形的细胞1。它们的变形性与其携氧功能直接相关。已发现红细胞变形性降低与几种红细胞疾病的发病机制相关2。变形性测量使我们更好地了解了红细胞相关疾病3。红细胞的正常寿命可以从 70 天到 140天不等4。因此，测量它们的变形性如何随着老化过程而降低非常重要，例如，它们由于循环剪切应力引起的疲劳行为3。
在高通量下测量红细胞变形性具有挑战性，因为皮克顿尺度力（~10-12 N）施加到单个细胞上。在过去的十年中，已经开发了许多技术来测量细胞变形性5。红细胞水平的变形测量可以通过移液管抽吸和光镊进行，而批量分析则通过渗透梯度 ektacyto 仪完成。Ektacytometry分析提供了丰富的数据，这为诊断血液疾病提供了机会6,7。红细胞的变形性也可以通过胶体探针原子力显微镜使用粘弹性理论进行分析。该方法应用计算分析来估计RBC的弹性模量，同时考虑了时变和稳态响应。单个红细胞的变形能力可以通过使用单细胞微室阵列方法进行测量。该方法通过膜和胞质荧光标记物分析每个细胞，为红细胞变形性和复杂红细胞群中细胞特征的分布提供信息，以检测血液系统疾病8。
疲劳是工程材料和生物材料性能退化的关键因素。疲劳测试可以对承受循环载荷的结构的完整性和寿命进行定量分析。长期以来，由于缺乏一种通用的、易于应用的、高通量和定量的方法来实施细胞膜中的循环变形，生物细胞疲劳分析一直受到阻碍。这可以通过在微流体环境中利用电信号调制和电形成技术来实现。本文通过开-关键控（OOK）调制应用幅度移键控（ASK）技术作为数字调制。键控的概念是指通过通道传输数字信号，这需要正弦波载波信号才能正常工作9。开和关时间可以设置为相等。在ON键控下，红细胞在暴露于由非均匀电场产生的外部电形成力（Fdep）10 时进入变形状态。在“脱键”下，RBC 处于放松状态。我们观察到红细胞的疲劳，即随着加载周期的增加，它们的拉伸能力逐渐下降。红细胞中疲劳诱导的变形性丧失可以提供对血液循环过程中累积的膜损伤的见解，使我们能够进一步研究细胞疲劳与疾病状态之间的联系。
在这里，我们提供了有关如何通过ASK调制电形成在微流体装置中实施红细胞疲劳测试的分步程序，以及微流体装置，机械负载和微观想象等系统设置，以表征红细胞机械变形的逐渐退化。
Protocol
Representative Results
Discussion
DEP 力诱导正弦波的 ASK OOK 调制可用于长时间测试红细胞的机械疲劳。在该协议中，我们将体外疲劳测试限制在1小时，以防止对细胞变形能力的潜在不良代谢影响。可以使用ASK调制电形成技术对综合疲劳测试条件进行编程。加载频率、幅度和加载速率等参数都可以编程。加载频率可以编程为不同的值，以确定疲劳对加载频率的依赖性以及循环加载和静态加载之间的差异13。
<p c…Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项研究由NSF / CMMI基于血红蛋白的人造氧气载体的机械生物学（#1941655）和NSF / CMMI健康和患病红细胞的动态和疲劳分析（#1635312）资助。
Materials
| Balance Scale | ViBRA | HT-224R | |
| Bandpass filter | BRIGHTLINE | 414/46 BrightLine HC | |
| BD Disposable Syringes with Luer-Lok™ Tips, 1 mL | Fisher Scientific | 14-823-30 | |
| Biopsy Punches with Plunger System, 1.5 mm | Fisher Scientific | 12-460-403 | |
| Biopsy Punches with Plunger System, 3 mm | Fisher Scientific | 12-460-407 | 1.5 mm and 3 mm diameter |
| Blunt needle, 23-gauge | BSTEAN | X001308N97 | |
| Bovin Serum Albumin | RMBIO | BSA-BSH | |
| Centrifuge | SCILOGEX | 911015119999 | |
| Conical Tube, 50 mL | Fisher Scientific | 05-539-13 | |
| Dextrose | Fisher Scientific | MDX01455 | MilliporeSigma™ |
| EC Low Conductivity meter | ecoTestr | 358/03 | |
| Eppendorf Snap-Cap MicrocentrifugeTubes | www.eppendorf.com | 05-402-25 | |
| Excel | Microsoft | Graph plotting | |
| Function Generator | SIGLENT | SDG830 | |
| Glass/ITO Electrode Substrate | OSSILA | S161 | |
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Inverted Microscope | OLYMPUS | IX81 – SN9E07015 | |
| Lab Oven | QUINCY LAB (QL) | MODEL 30GCE | Digital Model |
| Matlab | MathWorks | Graph plotting | |
| Micro Osmometer – Model 3300 | Advanced Instruments Inc. | S/N: 03050397P | |
| Parafilm Laboratory Wrapping Film | Fisher Scientific | 13-374-12 | |
| Petri dish | FALCON | SKU=351006 | ICSI/Biopsydish 50*9 mm |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | LONZA | 04-479Q | |
| Plasma Cleaner | Harrick plasma PDCOOL | NC0301989 | |
| Solidworks | Dassault Systemes | CAD software | |
| Sucrose | Fisher Scientific | 50-188-2419 | |
| Vacuum Desiccator | SPBEL-ART | F42400-2121 | |
| Wooden spatula | Fisher Scientific | NC0304136 | Tongue Depressors Wood NS 6" |
Riferimenti
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