Amplitudemoduleret elektrodeformation til evaluering af mekanisk træthed af biologiske celler
Summary
Her præsenteres en protokol for mekanisk træthedstest i tilfælde af humane røde blodlegemer ved hjælp af en amplitudemoduleret elektrodeformationsmetode. Denne generelle tilgang kan bruges til at måle de systematiske ændringer i morfologiske og biomekaniske egenskaber ved biologiske celler i en suspension fra cyklisk deformation.
Abstract
Røde blodlegemer (RBC’er) er kendt for deres bemærkelsesværdige deformerbarhed. De gennemgår gentagne gange betydelig deformation, når de passerer gennem mikrocirkulationen. Reduceret deformerbarhed ses i fysiologisk ældede RBC’er. Eksisterende teknikker til måling af celledeformerbarhed kan ikke let bruges til måling af træthed, den gradvise nedbrydning i cellemembraner forårsaget af cykliske belastninger. Vi præsenterer en protokol til evaluering af mekanisk nedbrydning i RBC’er fra cykliske forskydningsspændinger ved hjælp af amplitude shift keying (ASK) modulationsbaseret elektrodeformation i en mikrofluidisk kanal. Kort fortalt er de interdigiterede elektroder i den mikrofluidiske kanal spændt med en lavspændingsvekselstrøm ved radiofrekvenser ved hjælp af en signalgenerator. RBC’er i suspension reagerer på det elektriske felt og udviser positiv dielektroforese (DEP), som bevæger celler til elektrodekanterne. Celler strækkes derefter på grund af de elektriske kræfter, der udøves på de to cellehalvdele, hvilket resulterer i uniaxial strækning, kendt som elektrodeformation. Niveauet af forskydningsspænding og den resulterende deformation kan let justeres ved at ændre excitationsbølgens amplitude. Dette muliggør kvantificeringer af ikke-lineær deformerbarhed af RBC’er som reaktion på små og store deformationer ved høj gennemstrømning. Ændring af excitationsbølgen med ASK-strategien inducerer cyklisk elektrodeformation med programmerbare belastningshastigheder og frekvenser. Dette giver en bekvem måde til karakterisering af RBC træthed. Vores ASK-modulerede elektrodeformationsmetode muliggør for første gang en direkte måling af RBC-træthed fra cykliske belastninger. Det kan bruges som et værktøj til generel biomekanisk testning, til analyser af celledeformerbarhed og træthed i andre celletyper og syge tilstande og kan også kombineres med strategier til at kontrollere cellernes mikromiljø, såsom iltspænding og biologiske og kemiske signaler.
Introduction
Røde blodlegemer (RBC’er) er de mest deformerbare celler i menneskekroppen1. Deres deformerbarhed er direkte relateret til deres iltbærende funktionalitet. Reduceret deformerbarhed i RBC’er har vist sig at korrelere med patogenesen af flere RBC-lidelser2. Deformerbarhedsmålinger har ført os til en bedre forståelse af RBC-relaterede sygdomme3. Den normale levetid for RBC’er kan variere fra 70 til 140 dag4. Derfor er det vigtigt at måle, hvordan deres deformerbarhed falder sammen med aldringsprocessen, f.eks. deres træthedsadfærd på grund af cykliske forskydningsspændinger3.
Måling af RBC-deformerbarhed ved høj gennemstrømning er udfordrende på grund af piconewtonskalakræfterne (~ 10-12 N), der påføres de enkelte celler. I løbet af det sidste årti er der udviklet mange teknologier til måling af celledeformerbarhed5. Deformationsmålinger af RBC’er på enkeltcelleniveau kan udføres ved pipetteaspiration og optisk pincet, mens bulkanalyser udføres ved osmotisk gradientektacytometri. Ektacytometrianalyser giver en overflod af data, som giver mulighed for at diagnosticere blodsygdomme 6,7. Deformerbarheden af RBC’er kan også analyseres ved anvendelse af den viskoelastiske teori ved kolloid sonde atomkraftmikroskopi. I denne metode anvendes beregningsanalyse til at estimere det elastiske modul af RBC’er under hensyntagen til både tidsafhængige og steady-state-reaktioner. Deformerbarheden af individuelle RBC’er kan måles ved hjælp af enkeltcelle mikrokammerarray-metoden. Denne metode analyserer hver celle gennem membranen og cytosoliske fluorescerende markører for at give information om RBC-deformerbarhed og fordelingen af cellulære egenskaber i komplekse RBC-populationer for at detektere hæmatologiske lidelser8.
Træthed er en nøglefaktor i nedbrydningen af egenskaber af konstruerede materialer og biomaterialer. Udmattelsestest muliggør en kvantitativ analyse af integriteten og levetiden af en struktur, der udsættes for cyklisk belastning. Analyse af træthed i biologiske celler har længe været hæmmet af manglen på en generel, let anvendelig, høj gennemstrømning og kvantitativ metode til implementering af cyklisk deformation i cellemembraner. Dette er muligt ved anvendelse af elektrisk signalmodulation og elektrodeformationsteknikker implementeret i en mikrofluidisk indstilling. ASK-teknikken (amplitude shift keying) som en digital modulation anvendes via OOK-modulation (On-Off keying) i denne artikel. Begrebet keying refererer til transmission af digitale signaler over kanalen, hvilket kræver et sinusbølgebærersignal for at fungere9. ON- og OFF-tiderne kan indstilles ens. Under ON-keying går RBC’er ind i en deformeret tilstand, mens de udsættes for en ekstern elektrodeformationskraft (Fdep)10 skabt af det uensartede elektriske felt. Under OFF-keying er RBC’er i deres afslappede tilstand. Vi observerer træthed af RBC’er, nemlig en progressiv nedbrydning i deres evne til at strække sig med stigende belastningscyklusser. Det træthedsinducerede deformerbarhedstab i RBC’er kan give indsigt i den akkumulerede membranskade under blodcirkulationen, så vi yderligere kan undersøge forbindelserne mellem celletræthed og sygdomstilstande.
Her leverer vi trinvise procedurer for, hvordan træthedstest af RBC’er implementeres i en mikrofluidisk enhed via ASK-moduleret elektrodeformation og systemindstillingerne såsom mikrofluidisk enhed, mekanisk belastning og mikroskopisk forestilling til karakterisering af den gradvise nedbrydning i mekanisk deformerbarhed af RBC’er.
Protocol
Representative Results
Discussion
ASK OOK-modulationen af en DEP-kraftinducerende sinusbølge kan bruges til at teste den mekaniske træthed af RBC’er over en lang periode. I denne protokol begrænsede vi in vitro-træthedstesten til 1 time for at forhindre de potentielle negative metaboliske virkninger på celledeformerbarheden. Omfattende udmattelsestestbetingelser kan programmeres ved hjælp af ASK-moduleret elektrodeformationsteknik. Parametre som belastningsfrekvens, amplitude og belastningshastighed kan alle programmeres. Belastningsfrekvensen kan …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne forskning er finansieret af NSF / CMMI Mechanobiology of Hemoglobin-Based Artificial Oxygen Carriers (# 1941655) og NSF / CMMI Dynamic and Fatigue Analysis of Healthy and Diseased Red Blood Cells (# 1635312).
Materials
| Balance Scale | ViBRA | HT-224R | |
| Bandpass filter | BRIGHTLINE | 414/46 BrightLine HC | |
| BD Disposable Syringes with Luer-Lok™ Tips, 1 mL | Fisher Scientific | 14-823-30 | |
| Biopsy Punches with Plunger System, 1.5 mm | Fisher Scientific | 12-460-403 | |
| Biopsy Punches with Plunger System, 3 mm | Fisher Scientific | 12-460-407 | 1.5 mm and 3 mm diameter |
| Blunt needle, 23-gauge | BSTEAN | X001308N97 | |
| Bovin Serum Albumin | RMBIO | BSA-BSH | |
| Centrifuge | SCILOGEX | 911015119999 | |
| Conical Tube, 50 mL | Fisher Scientific | 05-539-13 | |
| Dextrose | Fisher Scientific | MDX01455 | MilliporeSigma™ |
| EC Low Conductivity meter | ecoTestr | 358/03 | |
| Eppendorf Snap-Cap MicrocentrifugeTubes | www.eppendorf.com | 05-402-25 | |
| Excel | Microsoft | Graph plotting | |
| Function Generator | SIGLENT | SDG830 | |
| Glass/ITO Electrode Substrate | OSSILA | S161 | |
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Inverted Microscope | OLYMPUS | IX81 – SN9E07015 | |
| Lab Oven | QUINCY LAB (QL) | MODEL 30GCE | Digital Model |
| Matlab | MathWorks | Graph plotting | |
| Micro Osmometer – Model 3300 | Advanced Instruments Inc. | S/N: 03050397P | |
| Parafilm Laboratory Wrapping Film | Fisher Scientific | 13-374-12 | |
| Petri dish | FALCON | SKU=351006 | ICSI/Biopsydish 50*9 mm |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | LONZA | 04-479Q | |
| Plasma Cleaner | Harrick plasma PDCOOL | NC0301989 | |
| Solidworks | Dassault Systemes | CAD software | |
| Sucrose | Fisher Scientific | 50-188-2419 | |
| Vacuum Desiccator | SPBEL-ART | F42400-2121 | |
| Wooden spatula | Fisher Scientific | NC0304136 | Tongue Depressors Wood NS 6" |
Riferimenti
- Kim, Y., Kim, K., Park, Y. Measurement techniques for red blood cell deformability: recent advances. Blood Cell—An Overview of Studies in Hematology. 10, 167-194 (2012).
- Safeukui, I., et al. Quantitative assessment of sensing and sequestration of spherocytic erythrocytes by the human spleen. Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 120 (2), 424-430 (2012).
- Naghedi-Baghdar, H., et al. Effect of diet on blood viscosity in healthy humans: a systematic review. Electronic physician. 10 (3), 6563 (2018).
- Franco, R. S. Measurement of red cell lifespan and aging. Transfusion Medicine and Hemotherapy. 39 (5), 302-307 (2012).
- Matthews, K., Lamoureux, E. S., Myrand-Lapierre, M. -. E., Duffy, S. P., Ma, H. Technologies for measuring red blood cell deformability. Lab on a Chip. 22, 1254-1274 (2022).
- Kim, J., Lee, H., Shin, S. Advances in the measurement of red blood cell deformability: A brief review. Journal of Cellular Biotechnology. 1 (1), 63-79 (2015).
- Varga, A., Matrai, A. A., Barath, B., Deak, A., Horvath, L., Nemeth, N. Interspecies diversity of osmotic gradient deformability of red blood cells in human and seven vertebrate animal species. Cells. 11 (8), 1351 (2022).
- Doh, I., Lee, W. C., Cho, Y. -. H., Pisano, A. P., Kuypers, F. A. Deformation measurement of individual cells in large populations using a single-cell microchamber array chip. Applied Physics Letters. 100 (17), 173702 (2012).
- Al Safi, A., Bazuin, B. Toward digital transmitters with amplitude shift keying and quadrature amplitude modulators implementation examples. , 1-7 (2017).
- Zhang, J., Chen, K., Fan, Z. H. Circulating tumor cell isolation and analysis. Advances in Clinical Chemistry. 75, 1-31 (2016).
- Cottet, J., Fabregue, O., Berger, C., Buret, F., Renaud, P., Frénéa-Robin, M. MyDEP: a new computational tool for dielectric modeling of particles and cells. Biophysical Journal. 116 (1), 12-18 (2019).
- Haywood, M. Interpreting the full blood count. InnovAiT. 15 (3), 131-137 (2022).
- Qiang, Y., Liu, J., Dao, M., Suresh, S., Du, E. Mechanical fatigue of human red blood cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (40), 19828-19834 (2019).
- Gharaibeh, B., et al. Isolation of a slowly adhering cell fraction containing stem cells from murine skeletal muscle by the preplate technique. Nature Protocols. 3 (9), 1501-1509 (2008).
- Qiang, Y., Liu, J., Dao, M., Du, E. In vitro assay for single-cell characterization of impaired deformability in red blood cells under recurrent episodes of hypoxia. Lab on a Chip. 21 (18), 3458-3470 (2021).
