Électrodéformation modulée en amplitude pour évaluer la fatigue mécanique des cellules biologiques
Summary
Un protocole d’essai de fatigue mécanique dans le cas de globules rouges humains utilisant une approche d’électrodéformation modulée en amplitude est présenté ici. Cette approche générale peut être utilisée pour mesurer les changements systématiques dans les caractéristiques morphologiques et biomécaniques des cellules biologiques dans une suspension de déformation cyclique.
Abstract
Les globules rouges (GR) sont connus pour leur remarquable déformabilité. Ils subissent à plusieurs reprises une déformation considérable lors de leur passage dans la microcirculation. Une déformabilité réduite est observée chez les globules rouges physiologiquement âgés. Les techniques existantes pour mesurer la déformabilité cellulaire ne peuvent pas être facilement utilisées pour mesurer la fatigue, la dégradation progressive des membranes cellulaires causée par les charges cycliques. Nous présentons un protocole pour évaluer la dégradation mécanique des globules rouges à partir de contraintes de cisaillement cycliques en utilisant l’électrodéformation basée sur la modulation par décalage d’amplitude (ASK) dans un canal microfluidique. En bref, les électrodes interdigitées dans le canal microfluidique sont excitées par un courant alternatif basse tension aux fréquences radio à l’aide d’un générateur de signaux. Les globules rouges en suspension réagissent au champ électrique et présentent une diélectrophorèse positive (DEP), qui déplace les cellules vers les bords de l’électrode. Les cellules sont ensuite étirées en raison des forces électriques exercées sur les deux moitiés de cellules, ce qui entraîne un étirement uniaxial, connu sous le nom d’électrodéformation. Le niveau de contrainte de cisaillement et la déformation résultante peuvent être facilement ajustés en modifiant l’amplitude de l’onde d’excitation. Cela permet de quantifier la déformabilité non linéaire des globules rouges en réponse à des déformations petites et grandes à haut débit. La modification de l’onde d’excitation avec la stratégie ASK induit une électrodéformation cyclique avec des taux de charge et des fréquences programmables. Il s’agit d’un moyen pratique de caractériser la fatigue liée aux globules rouges. Notre approche d’électrodéformation modulée ASK permet, pour la première fois, une mesure directe de la fatigue des globules rouges à partir de charges cycliques. Il peut être utilisé comme outil pour les tests biomécaniques généraux, pour les analyses de la déformabilité cellulaire et de la fatigue dans d’autres types de cellules et conditions malades, et peut également être combiné avec des stratégies pour contrôler le microenvironnement des cellules, telles que la tension d’oxygène et les indices biologiques et chimiques.
Introduction
Les globules rouges (GR) sont les cellules les plus déformables du corps humain1. Leur déformabilité est directement liée à leur fonctionnalité de transport d’oxygène. On a constaté que la déformabilité réduite des globules rouges était corrélée à la pathogenèse de plusieurs troubles des globules rouges2. Les mesures de déformabilité nous ont permis de mieux comprendre les maladies liées aux globules rouges3. La durée de vie normale des globules rouges peut varier de 70 à 140 jours4. Par conséquent, il est important de mesurer comment leur déformabilité diminue avec le processus de vieillissement, par exemple, leur comportement à la fatigue dû aux contraintes de cisaillement cycliques3.
La mesure de la déformabilité des globules rouges à haut débit est difficile en raison des forces d’échelle de piconewton (~10-12 N) appliquées aux cellules individuelles. Au cours de la dernière décennie, de nombreuses technologies ont été développées pour mesurer la déformabilité cellulaire5. Les mesures de déformation des globules rouges au niveau de la cellule unique peuvent être effectuées par aspiration à pipette et pince optique, tandis que les analyses globales sont effectuées par ektacytométrie à gradient osmotique. Les analyses d’ektacytométrie fournissent une abondance de données, ce qui permet de diagnostiquer les troubles sanguins 6,7. La déformabilité des globules rouges peut également être analysée à l’aide de la théorie viscoélastique par microscopie à force atomique à sonde colloïdale. Dans cette méthode, l’analyse informatique est appliquée pour estimer le module d’élasticité des globules rouges, en tenant compte à la fois des réponses dépendantes du temps et de l’état d’équilibre. La déformabilité des globules rouges individuels peut être mesurée à l’aide de la méthode des réseaux à microchambres unicellulaires. Cette méthode analyse chaque cellule à travers la membrane et les marqueurs fluorescents cytosoliques pour fournir des informations sur la déformabilité des globules rouges et la distribution des caractéristiques cellulaires dans les populations complexes de globules rouges afin de détecter les troubles hématologiques8.
La fatigue est un facteur clé dans la dégradation des propriétés des matériaux manufacturés et des biomatériaux. Les essais de fatigue permettent une analyse quantitative de l’intégrité et de la longévité d’une structure soumise à une charge cyclique. L’analyse de la fatigue dans les cellules biologiques a longtemps été entravée par l’absence d’une méthode générale, facilement applicable, à haut débit et quantitative pour la mise en œuvre de la déformation cyclique dans les membranes cellulaires. Ceci est possible grâce à l’utilisation de techniques de modulation et d’électrodéformation du signal électrique mises en œuvre dans un environnement microfluidique. La technique de modulation par décalage d’amplitude (ASK) en tant que modulation numérique est appliquée via la modulation On-Off (OOK) dans cet article. Le concept de keying fait référence à la transmission de signaux numériques sur le canal, ce qui nécessite un signal porteur sinusoïdal pour fonctionner9. Les heures ON et OFF peuvent être égales. Dans le cadre de la saisie ON, les globules rouges entrent dans un état déformé lorsqu’ils sont exposés à une force d’électrodéformation externe (Fdep)10 créée par le champ électrique non uniforme. Dans le cadre de la saisie OFF, les globules rouges sont dans leur état détendu. Nous observons la fatigue des globules rouges, à savoir une dégradation progressive de leur capacité à s’étirer avec l’augmentation des cycles de charge. La perte de déformabilité induite par la fatigue dans les globules rouges peut fournir des informations sur les dommages membranaires accumulés pendant la circulation sanguine, ce qui nous permet d’étudier plus avant les liens entre la fatigue cellulaire et les états pathologiques.
Nous fournissons ici des procédures étape par étape sur la façon dont les tests de fatigue des globules rouges sont mis en œuvre dans un dispositif microfluidique via une électrodéformation modulée ASK et les paramètres du système tels que le dispositif microfluidique, la charge mécanique et l’imagerie microscopique pour la caractérisation de la dégradation progressive de la déformabilité mécanique des globules rouges.
Protocol
Representative Results
Discussion
La modulation ASK OOK d’une onde sinusoïdale induisant une force DEP peut être utilisée pour tester la fatigue mécanique des globules rouges sur une longue période de temps. Dans ce protocole, nous avons limité les tests de fatigue in vitro à 1 heure pour prévenir les effets métaboliques indésirables potentiels sur la déformabilité cellulaire. Des conditions complètes d’essai de fatigue peuvent être programmées à l’aide de la technique d’électrodéformation modulée ASK. Des paramètres tels que …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette recherche a été financée par NSF/CMMI Mechanobiology of Hemoglobin-Based Artificial Oxygen Carriers (#1941655) et NSF/CMMI Dynamic and Fatigue Analysis of Healthy and Diseased Red Blood Cells (#1635312).
Materials
| Balance Scale | ViBRA | HT-224R | |
| Bandpass filter | BRIGHTLINE | 414/46 BrightLine HC | |
| BD Disposable Syringes with Luer-Lok™ Tips, 1 mL | Fisher Scientific | 14-823-30 | |
| Biopsy Punches with Plunger System, 1.5 mm | Fisher Scientific | 12-460-403 | |
| Biopsy Punches with Plunger System, 3 mm | Fisher Scientific | 12-460-407 | 1.5 mm and 3 mm diameter |
| Blunt needle, 23-gauge | BSTEAN | X001308N97 | |
| Bovin Serum Albumin | RMBIO | BSA-BSH | |
| Centrifuge | SCILOGEX | 911015119999 | |
| Conical Tube, 50 mL | Fisher Scientific | 05-539-13 | |
| Dextrose | Fisher Scientific | MDX01455 | MilliporeSigma™ |
| EC Low Conductivity meter | ecoTestr | 358/03 | |
| Eppendorf Snap-Cap MicrocentrifugeTubes | www.eppendorf.com | 05-402-25 | |
| Excel | Microsoft | Graph plotting | |
| Function Generator | SIGLENT | SDG830 | |
| Glass/ITO Electrode Substrate | OSSILA | S161 | |
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Inverted Microscope | OLYMPUS | IX81 – SN9E07015 | |
| Lab Oven | QUINCY LAB (QL) | MODEL 30GCE | Digital Model |
| Matlab | MathWorks | Graph plotting | |
| Micro Osmometer – Model 3300 | Advanced Instruments Inc. | S/N: 03050397P | |
| Parafilm Laboratory Wrapping Film | Fisher Scientific | 13-374-12 | |
| Petri dish | FALCON | SKU=351006 | ICSI/Biopsydish 50*9 mm |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | LONZA | 04-479Q | |
| Plasma Cleaner | Harrick plasma PDCOOL | NC0301989 | |
| Solidworks | Dassault Systemes | CAD software | |
| Sucrose | Fisher Scientific | 50-188-2419 | |
| Vacuum Desiccator | SPBEL-ART | F42400-2121 | |
| Wooden spatula | Fisher Scientific | NC0304136 | Tongue Depressors Wood NS 6" |
Riferimenti
- Kim, Y., Kim, K., Park, Y. Measurement techniques for red blood cell deformability: recent advances. Blood Cell—An Overview of Studies in Hematology. 10, 167-194 (2012).
- Safeukui, I., et al. Quantitative assessment of sensing and sequestration of spherocytic erythrocytes by the human spleen. Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 120 (2), 424-430 (2012).
- Naghedi-Baghdar, H., et al. Effect of diet on blood viscosity in healthy humans: a systematic review. Electronic physician. 10 (3), 6563 (2018).
- Franco, R. S. Measurement of red cell lifespan and aging. Transfusion Medicine and Hemotherapy. 39 (5), 302-307 (2012).
- Matthews, K., Lamoureux, E. S., Myrand-Lapierre, M. -. E., Duffy, S. P., Ma, H. Technologies for measuring red blood cell deformability. Lab on a Chip. 22, 1254-1274 (2022).
- Kim, J., Lee, H., Shin, S. Advances in the measurement of red blood cell deformability: A brief review. Journal of Cellular Biotechnology. 1 (1), 63-79 (2015).
- Varga, A., Matrai, A. A., Barath, B., Deak, A., Horvath, L., Nemeth, N. Interspecies diversity of osmotic gradient deformability of red blood cells in human and seven vertebrate animal species. Cells. 11 (8), 1351 (2022).
- Doh, I., Lee, W. C., Cho, Y. -. H., Pisano, A. P., Kuypers, F. A. Deformation measurement of individual cells in large populations using a single-cell microchamber array chip. Applied Physics Letters. 100 (17), 173702 (2012).
- Al Safi, A., Bazuin, B. Toward digital transmitters with amplitude shift keying and quadrature amplitude modulators implementation examples. , 1-7 (2017).
- Zhang, J., Chen, K., Fan, Z. H. Circulating tumor cell isolation and analysis. Advances in Clinical Chemistry. 75, 1-31 (2016).
- Cottet, J., Fabregue, O., Berger, C., Buret, F., Renaud, P., Frénéa-Robin, M. MyDEP: a new computational tool for dielectric modeling of particles and cells. Biophysical Journal. 116 (1), 12-18 (2019).
- Haywood, M. Interpreting the full blood count. InnovAiT. 15 (3), 131-137 (2022).
- Qiang, Y., Liu, J., Dao, M., Suresh, S., Du, E. Mechanical fatigue of human red blood cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (40), 19828-19834 (2019).
- Gharaibeh, B., et al. Isolation of a slowly adhering cell fraction containing stem cells from murine skeletal muscle by the preplate technique. Nature Protocols. 3 (9), 1501-1509 (2008).
- Qiang, Y., Liu, J., Dao, M., Du, E. In vitro assay for single-cell characterization of impaired deformability in red blood cells under recurrent episodes of hypoxia. Lab on a Chip. 21 (18), 3458-3470 (2021).
