Amplitudenmodulierte Elektrodeformation zur Bewertung der mechanischen Ermüdung biologischer Zellen
Summary
Hier wird ein Protokoll für mechanische Ermüdungstests bei menschlichen roten Blutkörperchen unter Verwendung eines amplitudenmodulierten Elektrodeformationsansatzes vorgestellt. Dieser allgemeine Ansatz kann verwendet werden, um die systematischen Veränderungen der morphologischen und biomechanischen Eigenschaften biologischer Zellen in einer Suspension aus zyklischer Verformung zu messen.
Abstract
Rote Blutkörperchen (RBCs) sind für ihre bemerkenswerte Verformbarkeit bekannt. Sie erleiden beim Durchlaufen der Mikrozirkulation immer wieder erhebliche Verformungen. Bestehende Techniken zur Messung der Zellverformbarkeit können nicht ohne weiteres zur Messung der Ermüdung, d. h. des allmählichen Abbaus von Zellmembranen, der durch zyklische Belastungen verursacht wird, verwendet werden. Wir stellen ein Protokoll vor, um die mechanische Degradation in Erythrozyten durch zyklische Scherspannungen unter Verwendung der auf Amplitudenverschiebung (ASK) basierenden elektrodischen Verformung in einem mikrofluidischen Kanal zu bewerten. Kurz gesagt, werden die interdigitalisierten Elektroden im mikrofluidischen Kanal mit einem Niederspannungs-Wechselstrom bei Radiofrequenzen unter Verwendung eines Signalgenerators angeregt. Erythrozyten in Suspension reagieren auf das elektrische Feld und weisen eine positive Dielektrophorese (DEP) auf, die Zellen an die Elektrodenränder bewegt. Die Zellen werden dann aufgrund der elektrischen Kräfte, die auf die beiden Zellhälften ausgeübt werden, gedehnt, was zu einer einachsigen Dehnung führt, die als Elektroverformung bezeichnet wird. Die Höhe der Schubspannung und die daraus resultierende Verformung können einfach durch Änderung der Amplitude der Anregungswelle eingestellt werden. Dies ermöglicht Quantifizierungen der nichtlinearen Verformbarkeit von Erythrozyten als Reaktion auf kleine und große Verformungen bei hohem Durchsatz. Die Modifikation der Anregungswelle mit der ASK-Strategie induziert eine zyklische Elektrodeformation mit programmierbaren Belastungsraten und Frequenzen. Dies bietet eine bequeme Möglichkeit zur Charakterisierung der Erythrozytenermüdung. Unser ASK-modulierter Elektrodeformationsansatz ermöglicht erstmals eine direkte Messung der Erythrozytenermüdung durch zyklische Belastungen. Es kann als Werkzeug für allgemeine biomechanische Tests, für Analysen der Zellverformbarkeit und -ermüdung bei anderen Zelltypen und Krankheitszuständen verwendet werden und kann auch mit Strategien zur Kontrolle der Mikroumgebung von Zellen kombiniert werden, wie z. B. Sauerstoffspannung und biologische und chemische Hinweise.
Introduction
Rote Blutkörperchen (RBCs) sind die am stärksten verformbaren Zellen im menschlichen Körper1. Ihre Verformbarkeit steht in direktem Zusammenhang mit ihrer sauerstofftransportierenden Funktionalität. Es wurde festgestellt, dass eine reduzierte Verformbarkeit von Erythrozyten mit der Pathogenese verschiedener Erythrozytenerkrankungen korreliert2. Verformbarkeitsmessungen haben uns zu einem besseren Verständnis von Erythrozyten-assoziierten Erkrankungen geführt3. Die normale Lebensdauer von Erythrozyten kann zwischen 70 und 140 Tagenvariieren 4. Daher ist es wichtig zu messen, wie ihre Verformbarkeit mit dem Alterungsprozess abnimmt, z. B. ihr Ermüdungsverhalten aufgrund zyklischer Scherspannungen3.
Die Messung der Verformbarkeit von Erythrozyten bei hohem Durchsatz ist aufgrund der Piconewton-Skalenkräfte (~10-12 N), die auf die einzelnen Zellen ausgeübt werden, eine Herausforderung. In den letzten zehn Jahren wurden viele Technologien entwickelt, um die Verformbarkeit von Zellen zu messen5. Deformationsmessungen von Erythrozyten auf Einzelzellebene können durch Pipettenaspiration und optische Pinzette durchgeführt werden, während Massenanalysen durch osmotische Gradientenektazytometrie durchgeführt werden. Ektazytometrische Analysen liefern eine Fülle von Daten, die die Möglichkeit bieten, Bluterkrankungen zu diagnostizieren 6,7. Die Verformbarkeit von Erythrozyten kann auch mit Hilfe der viskoelastischen Theorie mittels Kolloidsonden-Rasterkraftmikroskopie analysiert werden. Bei dieser Methode wird eine computergestützte Analyse angewendet, um den Elastizitätsmodul von Erythrozyten zu schätzen, wobei sowohl zeitabhängige als auch stationäre Antworten berücksichtigt werden. Die Verformbarkeit einzelner Erythrozyten kann mit der Einzelzell-Mikrokammer-Array-Methode gemessen werden. Diese Methode analysiert jede Zelle durch die Membran und zytosolische Fluoreszenzmarker, um Informationen über die Verformbarkeit von Erythrozyten und die Verteilung zellulärer Eigenschaften in komplexen Erythrozytenpopulationen zu erhalten, um hämatologische Erkrankungen zu erkennen8.
Ermüdung ist ein Schlüsselfaktor für die Verschlechterung der Eigenschaften von technischen Materialien und Biomaterialien. Die Ermüdungsprüfung ermöglicht eine quantitative Analyse der Integrität und Langlebigkeit einer Struktur, die einer zyklischen Belastung ausgesetzt ist. Die Analyse der Ermüdung in biologischen Zellen wurde lange Zeit durch das Fehlen einer allgemeinen, leicht anwendbaren, quantitativen Methode für den hohen Durchsatz und die Implementierung zyklischer Deformation in Zellmembranen behindert. Dies ist durch den Einsatz von elektrischen Signalmodulations- und Elektrodeformationstechniken möglich, die in einer mikrofluidischen Umgebung implementiert sind. Die ASK-Technik (Amplitude Shift Keying) als digitale Modulation wird in diesem Artikel durch die On-Off-Keying-Modulation (OOK) angewendet. Das Konzept der Kodierung bezieht sich auf die Übertragung digitaler Signale über den Kanal, der ein Sinuswellenträgersignal benötigt, um 9zu funktionieren. Die Ein- und Ausschaltzeiten können gleich eingestellt werden. Unter EIN-Tasten treten Erythrozyten in einen verformten Zustand über, während sie einer externen Elektroformkraft (Fdep)10 ausgesetzt sind, die durch das ungleichmäßige elektrische Feld erzeugt wird. Unter OFF-Keying befinden sich RBCs in ihrem entspannten Zustand. Wir beobachten die Ermüdung von Erythrozyten, d.h. eine fortschreitende Verschlechterung ihrer Dehnungsfähigkeit mit zunehmender Belastungszyklen. Der ermüdungsbedingte Verlust der Verformbarkeit von Erythrozyten kann Einblicke in die akkumulierte Membranschädigung während der Blutzirkulation geben, so dass wir die Zusammenhänge zwischen Zellermüdung und Krankheitszuständen weiter untersuchen können.
Hier stellen wir Schritt-für-Schritt-Anleitungen zur Verfügung, wie die Ermüdungsprüfung von Erythrozyten in einem mikrofluidischen Gerät über ASK-modulierte Elektroverformung und die Systemeinstellungen wie mikrofluidische Vorrichtung, mechanische Belastung und mikroskopische Bildgebung zur Charakterisierung der allmählichen Degradation der mechanischen Verformbarkeit von Erythrozyten implementiert wird.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die ASK OOK-Modulation einer DEP-Kraft-induzierenden Sinuswelle kann verwendet werden, um die mechanische Ermüdung von Erythrozyten über einen langen Zeitraum zu testen. In diesem Protokoll haben wir die In-vitro-Ermüdungstests auf 1 Stunde begrenzt, um mögliche nachteilige metabolische Auswirkungen auf die Verformbarkeit der Zellen zu verhindern. Umfassende Ermüdungsprüfbedingungen können mit der ASK-modulierten Elektroverformungstechnik programmiert werden. Parameter wie Belastungsfrequenz, Amplitude und Belastu…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Forschung wurde von NSF/CMMI Mechanobiology of Hemoglobin-Based Artificial Oxygen Carriers (#1941655) und NSF/CMMI Dynamic and Fatigue Analysis of Healthy and Diseased Red Blood Cells (#1635312) finanziert.
Materials
| Balance Scale | ViBRA | HT-224R | |
| Bandpass filter | BRIGHTLINE | 414/46 BrightLine HC | |
| BD Disposable Syringes with Luer-Lok™ Tips, 1 mL | Fisher Scientific | 14-823-30 | |
| Biopsy Punches with Plunger System, 1.5 mm | Fisher Scientific | 12-460-403 | |
| Biopsy Punches with Plunger System, 3 mm | Fisher Scientific | 12-460-407 | 1.5 mm and 3 mm diameter |
| Blunt needle, 23-gauge | BSTEAN | X001308N97 | |
| Bovin Serum Albumin | RMBIO | BSA-BSH | |
| Centrifuge | SCILOGEX | 911015119999 | |
| Conical Tube, 50 mL | Fisher Scientific | 05-539-13 | |
| Dextrose | Fisher Scientific | MDX01455 | MilliporeSigma™ |
| EC Low Conductivity meter | ecoTestr | 358/03 | |
| Eppendorf Snap-Cap MicrocentrifugeTubes | www.eppendorf.com | 05-402-25 | |
| Excel | Microsoft | Graph plotting | |
| Function Generator | SIGLENT | SDG830 | |
| Glass/ITO Electrode Substrate | OSSILA | S161 | |
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Inverted Microscope | OLYMPUS | IX81 – SN9E07015 | |
| Lab Oven | QUINCY LAB (QL) | MODEL 30GCE | Digital Model |
| Matlab | MathWorks | Graph plotting | |
| Micro Osmometer – Model 3300 | Advanced Instruments Inc. | S/N: 03050397P | |
| Parafilm Laboratory Wrapping Film | Fisher Scientific | 13-374-12 | |
| Petri dish | FALCON | SKU=351006 | ICSI/Biopsydish 50*9 mm |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | LONZA | 04-479Q | |
| Plasma Cleaner | Harrick plasma PDCOOL | NC0301989 | |
| Solidworks | Dassault Systemes | CAD software | |
| Sucrose | Fisher Scientific | 50-188-2419 | |
| Vacuum Desiccator | SPBEL-ART | F42400-2121 | |
| Wooden spatula | Fisher Scientific | NC0304136 | Tongue Depressors Wood NS 6" |
Riferimenti
- Kim, Y., Kim, K., Park, Y. Measurement techniques for red blood cell deformability: recent advances. Blood Cell—An Overview of Studies in Hematology. 10, 167-194 (2012).
- Safeukui, I., et al. Quantitative assessment of sensing and sequestration of spherocytic erythrocytes by the human spleen. Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 120 (2), 424-430 (2012).
- Naghedi-Baghdar, H., et al. Effect of diet on blood viscosity in healthy humans: a systematic review. Electronic physician. 10 (3), 6563 (2018).
- Franco, R. S. Measurement of red cell lifespan and aging. Transfusion Medicine and Hemotherapy. 39 (5), 302-307 (2012).
- Matthews, K., Lamoureux, E. S., Myrand-Lapierre, M. -. E., Duffy, S. P., Ma, H. Technologies for measuring red blood cell deformability. Lab on a Chip. 22, 1254-1274 (2022).
- Kim, J., Lee, H., Shin, S. Advances in the measurement of red blood cell deformability: A brief review. Journal of Cellular Biotechnology. 1 (1), 63-79 (2015).
- Varga, A., Matrai, A. A., Barath, B., Deak, A., Horvath, L., Nemeth, N. Interspecies diversity of osmotic gradient deformability of red blood cells in human and seven vertebrate animal species. Cells. 11 (8), 1351 (2022).
- Doh, I., Lee, W. C., Cho, Y. -. H., Pisano, A. P., Kuypers, F. A. Deformation measurement of individual cells in large populations using a single-cell microchamber array chip. Applied Physics Letters. 100 (17), 173702 (2012).
- Al Safi, A., Bazuin, B. Toward digital transmitters with amplitude shift keying and quadrature amplitude modulators implementation examples. , 1-7 (2017).
- Zhang, J., Chen, K., Fan, Z. H. Circulating tumor cell isolation and analysis. Advances in Clinical Chemistry. 75, 1-31 (2016).
- Cottet, J., Fabregue, O., Berger, C., Buret, F., Renaud, P., Frénéa-Robin, M. MyDEP: a new computational tool for dielectric modeling of particles and cells. Biophysical Journal. 116 (1), 12-18 (2019).
- Haywood, M. Interpreting the full blood count. InnovAiT. 15 (3), 131-137 (2022).
- Qiang, Y., Liu, J., Dao, M., Suresh, S., Du, E. Mechanical fatigue of human red blood cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (40), 19828-19834 (2019).
- Gharaibeh, B., et al. Isolation of a slowly adhering cell fraction containing stem cells from murine skeletal muscle by the preplate technique. Nature Protocols. 3 (9), 1501-1509 (2008).
- Qiang, Y., Liu, J., Dao, M., Du, E. In vitro assay for single-cell characterization of impaired deformability in red blood cells under recurrent episodes of hypoxia. Lab on a Chip. 21 (18), 3458-3470 (2021).
