Elettrodeformazione modulata in ampiezza per valutare la fatica meccanica delle cellule biologiche
Summary
Presentato qui è un protocollo per i test di fatica meccanica nel caso dei globuli rossi umani utilizzando un approccio di elettrodeformazione modulata in ampiezza. Questo approccio generale può essere utilizzato per misurare i cambiamenti sistematici nelle caratteristiche morfologiche e biomeccaniche delle cellule biologiche in una sospensione da deformazione ciclica.
Abstract
I globuli rossi (RBC) sono noti per la loro notevole deformabilità. Subiscono ripetutamente una notevole deformazione quando passano attraverso il microcircolo. La ridotta deformabilità è osservata nei globuli rossi fisiologicamente invecchiati. Le tecniche esistenti per misurare la deformabilità cellulare non possono essere facilmente utilizzate per misurare la fatica, la graduale degradazione nelle membrane cellulari causata da carichi ciclici. Presentiamo un protocollo per valutare la degradazione meccanica nei globuli rossi da sollecitazioni di taglio cicliche utilizzando l’elettrodeformazione basata sulla modulazione ASK (Amplitude Shift Keying) in un canale microfluidico. In breve, gli elettrodi interdigitati nel canale microfluidico sono eccitati con una corrente alternata a bassa tensione a frequenze radio utilizzando un generatore di segnale. I globuli rossi in sospensione rispondono al campo elettrico e mostrano una dielettroforesi positiva (DEP), che sposta le cellule verso i bordi degli elettrodi. Le cellule vengono quindi allungate a causa delle forze elettriche esercitate sulle due metà delle cellule, con conseguente allungamento uniassiale, noto come elettrodeformazione. Il livello di sollecitazione di taglio e la deformazione risultante possono essere facilmente regolati modificando l’ampiezza dell’onda di eccitazione. Ciò consente di quantificare la deformabilità non lineare dei globuli rossi in risposta a piccole e grandi deformazioni ad alta produttività. La modifica dell’onda di eccitazione con la strategia ASK induce elettrodeformazione ciclica con velocità di carico e frequenze programmabili. Ciò fornisce un modo conveniente per la caratterizzazione della fatica dei globuli rossi. Il nostro approccio di elettrodeformazione modulato ASK consente, per la prima volta, una misurazione diretta della fatica dei globuli rossi da carichi ciclici. Può essere utilizzato come strumento per test biomeccanici generali, per analisi della deformabilità cellulare e della fatica in altri tipi di cellule e condizioni patologiche, e può anche essere combinato con strategie per controllare il microambiente delle cellule, come la tensione dell’ossigeno e segnali biologici e chimici.
Introduction
I globuli rossi (RBC) sono le cellule più deformabili nel corpo umano1. La loro deformabilità è direttamente correlata alla loro funzionalità di trasporto dell’ossigeno. È stato riscontrato che una ridotta deformabilità nei globuli rossi è correlata alla patogenesi di diversi disturbi dei globuli rossi2. Le misurazioni della deformabilità ci hanno portato a una migliore comprensione delle malattie correlate ai globuli rossi3. La durata normale dei globuli rossi può variare da 70 a 140 giorni4. Pertanto, è importante misurare come la loro deformabilità diminuisce insieme al processo di invecchiamento, ad esempio, il loro comportamento a fatica a causa di sollecitazioni cicliche di taglio3.
La misurazione della deformabilità dei globuli rossi ad alta produttività è impegnativa a causa delle forze della scala di Piconewton (~10-12 N) che vengono applicate alle singole celle. Negli ultimi dieci anni, sono state sviluppate molte tecnologie per misurare la deformabilità cellulare5. Le misurazioni della deformazione dei globuli rossi a livello di singola cellula possono essere eseguite mediante aspirazione di pipette e pinzette ottiche, mentre le analisi di massa vengono eseguite mediante ektacitometria a gradiente osmotico. Le analisi ektacitometriche forniscono un’abbondanza di dati, che offre l’opportunità di diagnosticare disturbi del sangue 6,7. La deformabilità dei globuli rossi può anche essere analizzata utilizzando la teoria viscoelastica mediante microscopia a forza atomica con sonda colloidale. In questo metodo, l’analisi computazionale viene applicata per stimare il modulo elastico dei globuli rossi, considerando sia le risposte dipendenti dal tempo che quelle stazionarie. La deformabilità dei singoli globuli rossi può essere misurata utilizzando il metodo dell’array di microcamere a cella singola. Questo metodo analizza ogni cellula attraverso la membrana e i marcatori fluorescenti citosolici per fornire informazioni sulla deformabilità dei globuli rossi e sulla distribuzione delle caratteristiche cellulari in popolazioni complesse di RBC per rilevare disturbi ematologici8.
La fatica è un fattore chiave nella degradazione delle proprietà dei materiali ingegnerizzati e dei biomateriali. I test a fatica consentono un’analisi quantitativa dell’integrità e della longevità di una struttura sottoposta a carico ciclico. L’analisi della fatica nelle cellule biologiche è stata a lungo ostacolata dalla mancanza di un metodo generale, facilmente applicabile, ad alto rendimento e quantitativo per l’implementazione della deformazione ciclica nelle membrane cellulari. Ciò è possibile con l’utilizzo di modulazione del segnale elettrico e tecniche di elettrodeformazione implementate in un ambiente microfluidico. La tecnica ASK (Amplitude Shift Keying) come modulazione digitale viene applicata tramite la modulazione OOK (On-Off Keying) in questo articolo. Il concetto di keying si riferisce alla trasmissione di segnali digitali sul canale, che richiede un segnale portante sinusoidale per funzionare9. I tempi di accensione e spegnimento possono essere impostati uguali. Sotto ON-keying, i globuli rossi entrano in uno stato deformato mentre sono esposti a una forza di elettrodeformazione esterna (Fdep)10 creata dal campo elettrico non uniforme. Sotto OFF-keying, i globuli rossi sono nel loro stato rilassato. Osserviamo la fatica dei globuli rossi, ovvero un progressivo degrado della loro capacità di allungarsi con l’aumentare dei cicli di carico. La perdita di deformabilità indotta dalla fatica nei globuli rossi può fornire informazioni sul danno accumulato dalla membrana durante la circolazione sanguigna, permettendoci di studiare ulteriormente le connessioni tra affaticamento cellulare e stati patologici.
Qui forniamo procedure passo-passo su come la prova di fatica dei globuli rossi è implementata in un dispositivo microfluidico tramite elettrodeformazione modulata ASK e le impostazioni del sistema come il dispositivo microfluidico, il carico meccanico e l’immaginazione microscopica per la caratterizzazione della degradazione graduale nella deformabilità meccanica dei globuli rossi.
Protocol
Representative Results
Discussion
La modulazione ASK OOK di un’onda sinusoidale che induce forza DEP può essere utilizzata per testare la fatica meccanica dei globuli rossi per un lungo periodo di tempo. In questo protocollo, abbiamo limitato il test di fatica in vitro a 1 ora per prevenire i potenziali effetti metabolici avversi sulla deformabilità cellulare. Le condizioni complete di prova di fatica possono essere programmate utilizzando la tecnica di elettrodeformazione modulata ASK. È possibile programmare parametri come la frequenza di caricament…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questa ricerca è stata finanziata da NSF / CMMI Mechanobiology of Hemoglobin-Based Artificial Oxygen Carriers (# 1941655) e NSF / CMMI Dynamic and Fatigue Analysis of Healthy and Diseased Red Blood Cells (# 1635312).
Materials
| Balance Scale | ViBRA | HT-224R | |
| Bandpass filter | BRIGHTLINE | 414/46 BrightLine HC | |
| BD Disposable Syringes with Luer-Lok™ Tips, 1 mL | Fisher Scientific | 14-823-30 | |
| Biopsy Punches with Plunger System, 1.5 mm | Fisher Scientific | 12-460-403 | |
| Biopsy Punches with Plunger System, 3 mm | Fisher Scientific | 12-460-407 | 1.5 mm and 3 mm diameter |
| Blunt needle, 23-gauge | BSTEAN | X001308N97 | |
| Bovin Serum Albumin | RMBIO | BSA-BSH | |
| Centrifuge | SCILOGEX | 911015119999 | |
| Conical Tube, 50 mL | Fisher Scientific | 05-539-13 | |
| Dextrose | Fisher Scientific | MDX01455 | MilliporeSigma™ |
| EC Low Conductivity meter | ecoTestr | 358/03 | |
| Eppendorf Snap-Cap MicrocentrifugeTubes | www.eppendorf.com | 05-402-25 | |
| Excel | Microsoft | Graph plotting | |
| Function Generator | SIGLENT | SDG830 | |
| Glass/ITO Electrode Substrate | OSSILA | S161 | |
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Inverted Microscope | OLYMPUS | IX81 – SN9E07015 | |
| Lab Oven | QUINCY LAB (QL) | MODEL 30GCE | Digital Model |
| Matlab | MathWorks | Graph plotting | |
| Micro Osmometer – Model 3300 | Advanced Instruments Inc. | S/N: 03050397P | |
| Parafilm Laboratory Wrapping Film | Fisher Scientific | 13-374-12 | |
| Petri dish | FALCON | SKU=351006 | ICSI/Biopsydish 50*9 mm |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | LONZA | 04-479Q | |
| Plasma Cleaner | Harrick plasma PDCOOL | NC0301989 | |
| Solidworks | Dassault Systemes | CAD software | |
| Sucrose | Fisher Scientific | 50-188-2419 | |
| Vacuum Desiccator | SPBEL-ART | F42400-2121 | |
| Wooden spatula | Fisher Scientific | NC0304136 | Tongue Depressors Wood NS 6" |
Riferimenti
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