生体細胞の機械的疲労を評価するための振幅変調電極形成
Summary
ここでは、振幅変調電極形成アプローチを使用したヒト赤血球の場合の機械的疲労試験のプロトコルを示します。この一般的なアプローチは、周期的変形からの懸濁液中の生物学的細胞の形態学的および生体力学的特性の系統的変化を測定するために使用することができる。
Abstract
赤血球(RBC)は、その顕著な変形能力で知られています。それらは微小循環を通過するときに繰り返しかなりの変形を受ける。変形能の低下は、生理学的に老化した赤血球で見られます。 細胞の変形能を測定する既存の技術は、周期的な負荷によって引き起こされる細胞膜の段階的な劣化である疲労の測定に容易に使用することはできません。マイクロ流体チャネルにおける振幅シフトキーイング(ASK)変調ベースの電極形成を使用して、周期的せん断応力による赤血球の機械的劣化を評価するためのプロトコルを提示します。簡単に説明すると、マイクロ流体チャネル内のインタージテッド電極は、信号発生器を使用して無線周波数で低電圧交流で励起される。浮遊中の赤血球は電界に反応し、細胞を電極の端に移動する正の誘電泳動(DEP)を示します。次に、2つのセルの半分にかかる電気力によりセルが引き伸ばされ、電着として知られる一軸延伸が発生します。せん断応力のレベルと結果として生じる変形は、励起波の振幅を変更することで簡単に調整できます。これにより、大小の変形に応じた赤血球の非線形変形能を高スループットで定量化できます。ASK法で励起波を変更すると、プログラム可能な負荷率と周波数で周期的な電極形成が誘導されます。これは、RBC疲労の特性評価に便利な方法を提供します。当社のASK変調電極形成アプローチにより、初めて、繰返し荷重からのRBC疲労の直接測定が可能になりました。一般的な生体力学的試験、他の細胞型や疾患状態における細胞の変形能や疲労の分析のためのツールとして使用でき、酸素圧や生物学的および化学的手がかりなどの細胞の微小環境を制御するための戦略と組み合わせることもできます。
Introduction
赤血球(RBC)は、人体で最も変形しやすい細胞です1。それらの変形能力はそれらの酸素運搬機能に直接関係している。赤血球の変形能の低下は、いくつかの赤血球障害の病因と相関することがわかっています2。変形能の測定により、赤血球関連疾患の理解が深まりました3。赤血球の通常の寿命は、70〜140日目4までさまざまです。したがって、それらの変形能力が時効プロセスとともにどのように低下するか、例えば、周期せん断応力による疲労挙動を測定することが重要です3。
ハイスループットでの赤血球変形能の測定は、個々の細胞にピコニュートンスケール力(~10-12 N)がかかるため、困難です。過去10年間で、細胞の変形能を測定するために多くの技術が開発されてきました5。単一細胞レベルでの赤血球の変形測定はピペット吸引と光ピンセットで、バルク分析は浸透圧勾配エクタサイトメトリーで行うことができます。エクタサイトメトリー分析は豊富なデータを提供し、血液疾患を診断する機会を提供します6,7。赤血球の変形能は、コロイドプローブ原子間力顕微鏡による粘弾性理論を用いて解析することもできる。この方法では、計算解析を適用して、時間依存応答と定常応答の両方を考慮して、赤血球の弾性率を推定します。個々の赤血球の変形能は、シングルセルマイクロチャンバーアレイ法を用いて測定することができる。この方法は、膜および細胞質蛍光マーカーを介して各細胞を分析し、血液疾患を検出するための複雑な赤血球集団における赤血球変形能および細胞特性の分布に関する情報を提供します8。
疲労は、工学材料および生体材料の特性の低下における重要な要因です。疲労試験により、繰返し荷重を受ける構造の完全性と寿命の定量的分析が可能になります。生体細胞における疲労の分析は、細胞膜における周期的変形の実施のための一般的で、容易に適用可能な、高スループットおよび定量的方法の欠如によって長い間妨げられてきた。これは、マイクロ流体設定で実装された電気信号変調および電気形成技術を利用することで可能になります。デジタル変調としての振幅シフトキーイング(ASK)技術は、この記事ではオンオフキーイング(OOK)変調を介して適用されます。キーイングの概念は、チャネルを介したデジタル信号の送信を指し、機能するには正弦波搬送波信号が必要です9。オン時間とオフ時間を等しく設定できます。ONキーイングでは、赤血球は不均一な電界によって生じる外部電化力(Fdep)10 にさらされながら変形状態になります。オフ キーイングでは、RBC はリラックス状態になります。RBCの疲労、すなわち負荷サイクルの増加に伴う伸び能力の漸進的な低下を観察します。赤血球の疲労による変形能の喪失は、血液循環中に蓄積された膜損傷に関する洞察を提供し、細胞疲労と病態との関係をさらに調査することを可能にします。
ここでは、ASK変調電極形成を介して赤血球の疲労試験がマイクロ流体デバイスにどのように実装されるか、および赤血球の機械的変形能の段階的な劣化の特性評価のためのマイクロ流体デバイス、機械的負荷、顕微鏡的想像などのシステム設定について段階的に説明します。
Protocol
Representative Results
Discussion
DEP力を誘導する正弦波のASK OOK変調を使用して、長期間にわたる赤血球の機械的疲労をテストできます。このプロトコルでは、細胞変形能に対する潜在的な代謝への悪影響を防ぐために、in vitro疲労試験を1時間に制限しました。包括的な疲労試験条件は、ASK変調電極形成技術を使用してプログラムできます。負荷周波数、振幅、負荷率などのパラメータはすべてプログラムできます。荷重周波…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、ヘモグロビンベースの人工酸素キャリアのNSF / CMMIメカノバイオロジー(#1941655)および健康および病気の赤血球のNSF / CMMI動的および疲労分析(#1635312)によって資金提供されています。
Materials
| Balance Scale | ViBRA | HT-224R | |
| Bandpass filter | BRIGHTLINE | 414/46 BrightLine HC | |
| BD Disposable Syringes with Luer-Lok™ Tips, 1 mL | Fisher Scientific | 14-823-30 | |
| Biopsy Punches with Plunger System, 1.5 mm | Fisher Scientific | 12-460-403 | |
| Biopsy Punches with Plunger System, 3 mm | Fisher Scientific | 12-460-407 | 1.5 mm and 3 mm diameter |
| Blunt needle, 23-gauge | BSTEAN | X001308N97 | |
| Bovin Serum Albumin | RMBIO | BSA-BSH | |
| Centrifuge | SCILOGEX | 911015119999 | |
| Conical Tube, 50 mL | Fisher Scientific | 05-539-13 | |
| Dextrose | Fisher Scientific | MDX01455 | MilliporeSigma™ |
| EC Low Conductivity meter | ecoTestr | 358/03 | |
| Eppendorf Snap-Cap MicrocentrifugeTubes | www.eppendorf.com | 05-402-25 | |
| Excel | Microsoft | Graph plotting | |
| Function Generator | SIGLENT | SDG830 | |
| Glass/ITO Electrode Substrate | OSSILA | S161 | |
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Inverted Microscope | OLYMPUS | IX81 – SN9E07015 | |
| Lab Oven | QUINCY LAB (QL) | MODEL 30GCE | Digital Model |
| Matlab | MathWorks | Graph plotting | |
| Micro Osmometer – Model 3300 | Advanced Instruments Inc. | S/N: 03050397P | |
| Parafilm Laboratory Wrapping Film | Fisher Scientific | 13-374-12 | |
| Petri dish | FALCON | SKU=351006 | ICSI/Biopsydish 50*9 mm |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | LONZA | 04-479Q | |
| Plasma Cleaner | Harrick plasma PDCOOL | NC0301989 | |
| Solidworks | Dassault Systemes | CAD software | |
| Sucrose | Fisher Scientific | 50-188-2419 | |
| Vacuum Desiccator | SPBEL-ART | F42400-2121 | |
| Wooden spatula | Fisher Scientific | NC0304136 | Tongue Depressors Wood NS 6" |
Riferimenti
- Kim, Y., Kim, K., Park, Y. Measurement techniques for red blood cell deformability: recent advances. Blood Cell—An Overview of Studies in Hematology. 10, 167-194 (2012).
- Safeukui, I., et al. Quantitative assessment of sensing and sequestration of spherocytic erythrocytes by the human spleen. Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 120 (2), 424-430 (2012).
- Naghedi-Baghdar, H., et al. Effect of diet on blood viscosity in healthy humans: a systematic review. Electronic physician. 10 (3), 6563 (2018).
- Franco, R. S. Measurement of red cell lifespan and aging. Transfusion Medicine and Hemotherapy. 39 (5), 302-307 (2012).
- Matthews, K., Lamoureux, E. S., Myrand-Lapierre, M. -. E., Duffy, S. P., Ma, H. Technologies for measuring red blood cell deformability. Lab on a Chip. 22, 1254-1274 (2022).
- Kim, J., Lee, H., Shin, S. Advances in the measurement of red blood cell deformability: A brief review. Journal of Cellular Biotechnology. 1 (1), 63-79 (2015).
- Varga, A., Matrai, A. A., Barath, B., Deak, A., Horvath, L., Nemeth, N. Interspecies diversity of osmotic gradient deformability of red blood cells in human and seven vertebrate animal species. Cells. 11 (8), 1351 (2022).
- Doh, I., Lee, W. C., Cho, Y. -. H., Pisano, A. P., Kuypers, F. A. Deformation measurement of individual cells in large populations using a single-cell microchamber array chip. Applied Physics Letters. 100 (17), 173702 (2012).
- Al Safi, A., Bazuin, B. Toward digital transmitters with amplitude shift keying and quadrature amplitude modulators implementation examples. , 1-7 (2017).
- Zhang, J., Chen, K., Fan, Z. H. Circulating tumor cell isolation and analysis. Advances in Clinical Chemistry. 75, 1-31 (2016).
- Cottet, J., Fabregue, O., Berger, C., Buret, F., Renaud, P., Frénéa-Robin, M. MyDEP: a new computational tool for dielectric modeling of particles and cells. Biophysical Journal. 116 (1), 12-18 (2019).
- Haywood, M. Interpreting the full blood count. InnovAiT. 15 (3), 131-137 (2022).
- Qiang, Y., Liu, J., Dao, M., Suresh, S., Du, E. Mechanical fatigue of human red blood cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (40), 19828-19834 (2019).
- Gharaibeh, B., et al. Isolation of a slowly adhering cell fraction containing stem cells from murine skeletal muscle by the preplate technique. Nature Protocols. 3 (9), 1501-1509 (2008).
- Qiang, Y., Liu, J., Dao, M., Du, E. In vitro assay for single-cell characterization of impaired deformability in red blood cells under recurrent episodes of hypoxia. Lab on a Chip. 21 (18), 3458-3470 (2021).
