Summary

Amplitudemodulert elektrodeformasjon for å evaluere mekanisk utmattelse av biologiske celler

Published: October 13, 2023
doi:

Summary

Presentert her er en protokoll for mekanisk utmattelsestesting i tilfelle av humane røde blodlegemer ved bruk av en amplitudemodulert elektrodeformasjonstilnærming. Denne generelle tilnærmingen kan brukes til å måle de systematiske endringene i morfologiske og biomekaniske egenskaper hos biologiske celler i en suspensjon fra syklisk deformasjon.

Abstract

Røde blodlegemer (RBC) er kjent for sin bemerkelsesverdige deformabilitet. De gjennomgår gjentatte ganger betydelig deformasjon når de passerer gjennom mikrosirkulasjonen. Redusert deformabilitet ses i fysiologisk aldrende RBC. Eksisterende teknikker for å måle celledeformabilitet kan ikke lett brukes til å måle tretthet, gradvis nedbrytning i cellemembraner forårsaket av sykliske belastninger. Vi presenterer en protokoll for å evaluere mekanisk nedbrytning i RBC fra sykliske skjærspenninger ved bruk av amplitude shift keying (ASK) modulasjonsbasert elektrodeformasjon i en mikrofluidisk kanal. Kort fortalt er de interdigiterte elektrodene i den mikrofluidiske kanalen begeistret med en lavspent vekselstrøm ved radiofrekvenser ved hjelp av en signalgenerator. RBC i suspensjon reagerer på det elektriske feltet og utviser positiv dielektroforese (DEP), som beveger celler til elektrodekantene. Cellene blir deretter strukket på grunn av de elektriske kreftene som utøves på de to cellehalvdelene, noe som resulterer i uniaxial strekking, kjent som elektrodeformasjon. Nivået av skjærspenning og den resulterende deformasjonen kan enkelt justeres ved å endre amplituden til eksitasjonsbølgen. Dette muliggjør kvantifiseringer av ikke-lineær deformabilitet av RBC som respons på små og store deformasjoner ved høy gjennomstrømning. Modifisering av eksitasjonsbølgen med ASK-strategien induserer syklisk elektrodeformasjon med programmerbare lasthastigheter og frekvenser. Dette gir en praktisk måte for karakterisering av RBC-tretthet. Vår ASK-modulerte elektrodeformasjonstilnærming muliggjør for første gang en direkte måling av RBC-tretthet fra sykliske belastninger. Det kan brukes som et verktøy for generell biomekanisk testing, for analyser av celledeformabilitet og tretthet i andre celletyper og syke tilstander, og kan også kombineres med strategier for å kontrollere mikromiljøet i celler, for eksempel oksygenspenning og biologiske og kjemiske signaler.

Introduction

Røde blodlegemer (RBC) er de mest deformerbare cellene i menneskekroppen1. Deres deformabilitet er direkte relatert til deres oksygenbærende funksjonalitet. Redusert deformabilitet i RBC har vist seg å korrelere med patogenesen av flere RBC-lidelser2. Deformabilitetsmålinger har ført oss til en bedre forståelse av RBC-relaterte sykdommer3. Den normale levetiden til RBC kan variere fra 70 til 140 dag4. Derfor er det viktig å måle hvordan deformabiliteten avtar sammen med aldringsprosessen, for eksempel utmattingsatferden på grunn av sykliske skjærspenninger3.

Måling av RBC-deformabilitet ved høy gjennomstrømning er utfordrende på grunn av piconewtonskalakreftene (~ 10-12 N) som påføres de enkelte cellene. I løpet av det siste tiåret har mange teknologier blitt utviklet for å måle celledeformabilitet5. Deformasjonsmålinger av RBC på encellenivå kan utføres ved pipetteaspirasjon og optisk pinsett, mens bulkanalyser gjøres ved osmotisk gradient ektacytometri. Ektacytometrianalyser gir en overflod av data, noe som gir mulighet til å diagnostisere blodsykdommer 6,7. Deformabiliteten til RBC kan også analyseres ved hjelp av viskoelastisk teori ved kolloid sonde atomkraftmikroskopi. I denne metoden brukes beregningsanalyse for å estimere den elastiske modulen til RBC, med tanke på både tidsavhengige og stabile responser. Deformabiliteten til individuelle RBC kan måles ved å bruke enkeltcelle mikrokammerarray-metoden. Denne metoden analyserer hver celle gjennom membranen og cytosoliske fluorescerende markører for å gi informasjon om RBC-deformabilitet og fordelingen av cellulære egenskaper i komplekse RBC-populasjoner for å oppdage hematologiske lidelser8.

Fatigue er en nøkkelfaktor i nedbrytningen av egenskapene til konstruerte materialer og biomaterialer. Utmattingstesting muliggjør en kvantitativ analyse av integriteten og levetiden til en konstruksjon utsatt for syklisk belastning. Analyse av tretthet i biologiske celler har lenge vært hemmet av mangelen på en generell, lett anvendelig, høy gjennomstrømning og kvantitativ metode for implementering av syklisk deformasjon i cellemembraner. Dette er mulig ved bruk av elektrisk signalmodulasjon og elektrodeformasjonsteknikker implementert i en mikrofluidisk setting. Amplitude shift-tasteteknikken (ASK) som en digital modulasjon brukes gjennom On-Off keying (OOK) modulasjon i denne artikkelen. Begrepet keying refererer til overføring av digitale signaler over kanalen, som krever et sinusbølgebærersignal for å fungere9. PÅ- og AV-tidene kan settes like. Under ON-keying går RBC-er inn i en deformert tilstand mens de utsettes for en ekstern elektrodeformasjonskraft (Fdep)10 opprettet av det ujevne elektriske feltet. Under OFF-keying er RBC i sin avslappede tilstand. Vi observerer tretthet av RBC, nemlig en progressiv nedbrytning i deres evne til å strekke seg med økende belastningssykluser. Det tretthetsinduserte deformabilitetstapet i RBC kan gi innsikt i den akkumulerte membranskaden under blodsirkulasjonen, slik at vi kan undersøke sammenhengen mellom celleutmattelse og sykdomstilstander ytterligere.

Her gir vi trinnvise prosedyrer for hvordan utmattingstesting av RBC implementeres i en mikrofluidisk enhet via ASK-modulert elektrodeformasjon og systeminnstillingene som mikrofluidisk enhet, mekanisk belastning og mikroskopisk avbildning for karakterisering av gradvis nedbrytning i mekanisk deformerbarhet av RBC.

Protocol

Avidentifisert humant fullblod ble kommersielt oppnådd. Arbeidet med blodprøvene ble utført i et biosikkerhetsnivå 2-laboratorium ved hjelp av protokoller godkjent av Institutional Biosafety Committee ved Florida Atlantic University. 1. Forberedelse av mikrofluidisk enhet Teip ned SU-8 master silisiumskiven for mikrofluidisk kanaldesign på innsiden av en plast 14 cm petriskål og rengjør den med N2 gass. Vei 60 g polydimetylsiloksan (PDMS) …

Representative Results

Når cellesuspensjon ble lastet i den mikrofluidiske kanalen, ble det observert en relativt jevn fordeling av celler. Ved signalutgangen (f.eks. en enkel sinusbølge eller On-Keying-fase av ASK) fra funksjonsgeneratoren, genererte de tynnfilminterdigiterte elektrodene et ujevnt elektrisk felt med vekselstrøm. De suspenderte cellene reagerte spontant på denne elektriske eksitasjonen og viste en positiv DEP-oppførsel, nemlig å bevege seg mot kantene av elektroder med høyere feltstyrke. Følgelig ble cellene justert la…

Discussion

ASK OOK-modulasjonen av en DEP-kraftinduserende sinusbølge kan brukes til å teste den mekaniske utmattingen av RBC over lang tid. I denne protokollen begrenset vi in vitro utmattelsestesting til 1 time for å forhindre potensielle negative metabolske effekter på celledeformabiliteten. Omfattende utmattingstestforhold kan programmeres ved hjelp av ASK-modulert elektrodeformasjonsteknikk. Parametere som lastefrekvens, amplitude og lasthastighet kan alle programmeres. Lastfrekvensen kan programmeres til varierende verdie…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Denne forskningen er finansiert av NSF / CMMI mekanobiologi av hemoglobinbaserte kunstige oksygenbærere (# 1941655) og NSF / CMMI dynamisk og utmattelsesanalyse av friske og syke røde blodlegemer (# 1635312).

Materials

Balance Scale ViBRA HT-224R
Bandpass filter BRIGHTLINE 414/46 BrightLine HC
BD Disposable Syringes with Luer-Lok™ Tips, 1 mL Fisher Scientific 14-823-30
Biopsy Punches with Plunger System, 1.5 mm Fisher Scientific 12-460-403
Biopsy Punches with Plunger System, 3 mm Fisher Scientific 12-460-407 1.5 mm and 3 mm diameter
Blunt needle, 23-gauge BSTEAN X001308N97
Bovin Serum Albumin RMBIO BSA-BSH
Centrifuge SCILOGEX 911015119999
Conical Tube, 50 mL Fisher Scientific 05-539-13
Dextrose Fisher Scientific MDX01455 MilliporeSigma™
EC Low Conductivity meter ecoTestr 358/03
Eppendorf   Snap-Cap MicrocentrifugeTubes www.eppendorf.com 05-402-25
Excel Microsoft  Graph plotting
Function Generator SIGLENT SDG830
Glass/ITO Electrode Substrate OSSILA S161
ImageJ NIH https://imagej.nih.gov/ij/
Inverted Microscope OLYMPUS IX81 – SN9E07015
Lab Oven QUINCY LAB (QL) MODEL 30GCE Digital Model
Matlab MathWorks Graph plotting
Micro Osmometer – Model 3300 Advanced Instruments Inc. S/N: 03050397P
Parafilm Laboratory Wrapping Film Fisher Scientific 13-374-12
Petri dish FALCON SKU=351006 ICSI/Biopsydish 50*9 mm
Phosphate Buffered Saline (PBS) LONZA 04-479Q
Plasma Cleaner Harrick plasma PDCOOL NC0301989
Solidworks Dassault Systemes CAD software
Sucrose Fisher Scientific 50-188-2419
Vacuum Desiccator SPBEL-ART F42400-2121
Wooden spatula Fisher Scientific NC0304136 Tongue Depressors Wood NS 6"

Riferimenti

  1. Kim, Y., Kim, K., Park, Y. Measurement techniques for red blood cell deformability: recent advances. Blood Cell—An Overview of Studies in Hematology. 10, 167-194 (2012).
  2. Safeukui, I., et al. Quantitative assessment of sensing and sequestration of spherocytic erythrocytes by the human spleen. Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 120 (2), 424-430 (2012).
  3. Naghedi-Baghdar, H., et al. Effect of diet on blood viscosity in healthy humans: a systematic review. Electronic physician. 10 (3), 6563 (2018).
  4. Franco, R. S. Measurement of red cell lifespan and aging. Transfusion Medicine and Hemotherapy. 39 (5), 302-307 (2012).
  5. Matthews, K., Lamoureux, E. S., Myrand-Lapierre, M. -. E., Duffy, S. P., Ma, H. Technologies for measuring red blood cell deformability. Lab on a Chip. 22, 1254-1274 (2022).
  6. Kim, J., Lee, H., Shin, S. Advances in the measurement of red blood cell deformability: A brief review. Journal of Cellular Biotechnology. 1 (1), 63-79 (2015).
  7. Varga, A., Matrai, A. A., Barath, B., Deak, A., Horvath, L., Nemeth, N. Interspecies diversity of osmotic gradient deformability of red blood cells in human and seven vertebrate animal species. Cells. 11 (8), 1351 (2022).
  8. Doh, I., Lee, W. C., Cho, Y. -. H., Pisano, A. P., Kuypers, F. A. Deformation measurement of individual cells in large populations using a single-cell microchamber array chip. Applied Physics Letters. 100 (17), 173702 (2012).
  9. Al Safi, A., Bazuin, B. Toward digital transmitters with amplitude shift keying and quadrature amplitude modulators implementation examples. , 1-7 (2017).
  10. Zhang, J., Chen, K., Fan, Z. H. Circulating tumor cell isolation and analysis. Advances in Clinical Chemistry. 75, 1-31 (2016).
  11. Cottet, J., Fabregue, O., Berger, C., Buret, F., Renaud, P., Frénéa-Robin, M. MyDEP: a new computational tool for dielectric modeling of particles and cells. Biophysical Journal. 116 (1), 12-18 (2019).
  12. Haywood, M. Interpreting the full blood count. InnovAiT. 15 (3), 131-137 (2022).
  13. Qiang, Y., Liu, J., Dao, M., Suresh, S., Du, E. Mechanical fatigue of human red blood cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (40), 19828-19834 (2019).
  14. Gharaibeh, B., et al. Isolation of a slowly adhering cell fraction containing stem cells from murine skeletal muscle by the preplate technique. Nature Protocols. 3 (9), 1501-1509 (2008).
  15. Qiang, Y., Liu, J., Dao, M., Du, E. In vitro assay for single-cell characterization of impaired deformability in red blood cells under recurrent episodes of hypoxia. Lab on a Chip. 21 (18), 3458-3470 (2021).
check_url/it/65897?article_type=t

Play Video

Citazione di questo articolo
Dieujuste, D., Alamouti, A. K., Xu, H., Du, E. Amplitude-Modulated Electrodeformation to Evaluate Mechanical Fatigue of Biological Cells. J. Vis. Exp. (200), e65897, doi:10.3791/65897 (2023).

View Video