Eletrodeformação modulada em amplitude para avaliação da fadiga mecânica de células biológicas
Summary
Apresentamos aqui um protocolo para testes de fadiga mecânica no caso de hemácias humanas usando uma abordagem de eletrodeformação modulada por amplitude. Esta abordagem geral pode ser usada para medir as mudanças sistemáticas nas características morfológicas e biomecânicas de células biológicas em uma suspensão por deformação cíclica.
Abstract
As hemácias (hemácias) são conhecidas por sua notável deformabilidade. Eles sofrem repetidamente considerável deformação ao passar pela microcirculação. A deformabilidade reduzida é observada em hemácias fisiologicamente envelhecidas. As técnicas existentes para medir a deformabilidade celular não podem ser facilmente usadas para medir a fadiga, a degradação gradual nas membranas celulares causada por cargas cíclicas. Apresentamos um protocolo para avaliar a degradação mecânica em hemácias a partir de tensões cíclicas de cisalhamento usando eletrodeformação baseada em modulação de amplitude shift keying (ASK) em um canal microfluídico. Resumidamente, os eletrodos interdigitalizados no canal microfluídico são excitados com uma corrente alternada de baixa tensão em radiofrequências usando um gerador de sinais. As hemácias em suspensão respondem ao campo elétrico e exibem dieletroforese positiva (DEP), que move as células para as bordas do eletrodo. As células são então esticadas devido às forças elétricas exercidas sobre as duas metades celulares, resultando em estiramento uniaxial, conhecido como eletrodeformação. O nível de tensão de cisalhamento e a deformação resultante podem ser facilmente ajustados alterando a amplitude da onda de excitação. Isso permite quantificações da deformabilidade não linear das hemácias em resposta a pequenas e grandes deformações em alto rendimento. A modificação da onda de excitação com a estratégia ASK induz eletrodeformação cíclica com taxas de carregamento e frequências programáveis. Isso fornece uma maneira conveniente para a caracterização da fadiga eritrocitária. Nossa abordagem de eletrodeformação modulada por ASK permite, pela primeira vez, uma medição direta da fadiga das hemácias a partir de cargas cíclicas. Ele pode ser usado como uma ferramenta para testes biomecânicos gerais, para análises de deformabilidade e fadiga celular em outros tipos celulares e condições doentes, e também pode ser combinado com estratégias para controlar o microambiente das células, como tensão de oxigênio e pistas biológicas e químicas.
Introduction
As hemácias (hemácias) são as células mais deformáveis do corpo humano1. Sua deformabilidade está diretamente relacionada à sua funcionalidade de transporte de oxigênio. Descobriu-se que a deformabilidade reduzida nas hemácias se correlaciona com a patogênese de várias doenças eritrocitárias2. Medidas de deformabilidade nos levaram a um melhor entendimento das doenças relacionadas às hemácias3. A vida normal das hemácias pode variar de 70 a 140 dias4. Portanto, é importante medir como sua deformabilidade diminui com o processo de envelhecimento, por exemplo, seu comportamento de fadiga devido a tensões cíclicas de cisalhamento3.
Medir a deformabilidade das hemácias em alto rendimento é um desafio devido às forças da escala de piconewton (~10-12 N) que são aplicadas às células individuais. Na última década, muitas tecnologias foram desenvolvidas para medir a deformabilidade celular5. Medidas de deformação de hemácias em nível de célula única podem ser realizadas por aspiração por pipeta e pinça óptica, enquanto as análises em massa são feitas por ectaciometria de gradiente osmótico. As análises de ectacitometria fornecem uma abundância de dados, o que oferece uma oportunidade para diagnosticar distúrbios sanguíneos 6,7. A deformabilidade das hemácias também pode ser analisada pela teoria viscoelástica por microscopia de força atômica com sonda coloide. Neste método, a análise computacional é aplicada para estimar o módulo de elasticidade das hemácias, considerando tanto respostas dependentes do tempo quanto do estado estacionário. A deformabilidade de hemácias individuais pode ser medida usando o método de arranjo de microcâmaras de célula única. Este método analisa cada célula através da membrana e marcadores fluorescentes citosólicos para fornecer informações sobre a deformabilidade das hemácias e a distribuição das características celulares em populações complexas de hemácias para detectar distúrbioshematológicos8.
A fadiga é um fator-chave na degradação das propriedades de materiais de engenharia e biomateriais. O teste de fadiga permite uma análise quantitativa da integridade e longevidade de uma estrutura submetida a cargas cíclicas. A análise da fadiga em células biológicas tem sido dificultada pela falta de um método geral, prontamente aplicável, de alto rendimento e quantitativo para a implementação da deformação cíclica nas membranas celulares. Isso é possível com a utilização de técnicas de modulação de sinal elétrico e eletrodeformação implementadas em ambiente microfluídico. A técnica de chaveamento de deslocamento de amplitude (ASK) como uma modulação digital é aplicada através da modulação On-Off keying (OOK) neste artigo. O conceito de chaveamento refere-se à transmissão de sinais digitais pelo canal, que requer um sinal portador de onda senoidal para funcionar9. Os tempos ON e OFF podem ser definidos iguais. Sob chaveamento ON, as hemácias entram em um estado deformado enquanto expostas a uma força de eletrodeformação externa (Fdep)10 criada pelo campo elétrico não uniforme. Sob OFF-keying, as hemácias estão em seu estado relaxado. Observamos a fadiga das hemácias, ou seja, uma degradação progressiva em sua capacidade de alongamento com o aumento dos ciclos de carga. A perda de deformabilidade induzida por fadiga em hemácias pode fornecer informações sobre o dano acumulado na membrana durante a circulação sanguínea, permitindo-nos investigar melhor as conexões entre fadiga celular e estados de doença.
Aqui nós fornecemos procedimentos passo-a-passo sobre como o teste de fadiga de hemácias é implementado em um dispositivo microfluídico via eletrodeformação modulada por ASK e as configurações do sistema, como dispositivo microfluídico, carregamento mecânico e imaginação microscópica para a caracterização da degradação gradual na deformabilidade mecânica de hemácias.
Protocol
Representative Results
Discussion
A modulação ASK OOK de uma onda senoidal indutora de força DEP pode ser usada para testar a fadiga mecânica de hemácias por um longo período de tempo. Neste protocolo, limitamos o teste de fadiga in vitro a 1 hora para prevenir os potenciais efeitos metabólicos adversos sobre a deformabilidade celular. Condições abrangentes de teste de fadiga podem ser programadas usando a técnica de eletrodeformação modulada por ASK. Parâmetros como frequência de carregamento, amplitude e taxa de carregamento podem ser pro…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta pesquisa foi financiada pela NSF/CMMI Mechanobiology of Hemoglobin-Based Artificial Oxygen Carriers (#1941655) e NSF/CMMI Dynamic and Fatigue Analysis of Healthy and Diseased Red Blood Cells (#1635312).
Materials
| Balance Scale | ViBRA | HT-224R | |
| Bandpass filter | BRIGHTLINE | 414/46 BrightLine HC | |
| BD Disposable Syringes with Luer-Lok™ Tips, 1 mL | Fisher Scientific | 14-823-30 | |
| Biopsy Punches with Plunger System, 1.5 mm | Fisher Scientific | 12-460-403 | |
| Biopsy Punches with Plunger System, 3 mm | Fisher Scientific | 12-460-407 | 1.5 mm and 3 mm diameter |
| Blunt needle, 23-gauge | BSTEAN | X001308N97 | |
| Bovin Serum Albumin | RMBIO | BSA-BSH | |
| Centrifuge | SCILOGEX | 911015119999 | |
| Conical Tube, 50 mL | Fisher Scientific | 05-539-13 | |
| Dextrose | Fisher Scientific | MDX01455 | MilliporeSigma™ |
| EC Low Conductivity meter | ecoTestr | 358/03 | |
| Eppendorf Snap-Cap MicrocentrifugeTubes | www.eppendorf.com | 05-402-25 | |
| Excel | Microsoft | Graph plotting | |
| Function Generator | SIGLENT | SDG830 | |
| Glass/ITO Electrode Substrate | OSSILA | S161 | |
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Inverted Microscope | OLYMPUS | IX81 – SN9E07015 | |
| Lab Oven | QUINCY LAB (QL) | MODEL 30GCE | Digital Model |
| Matlab | MathWorks | Graph plotting | |
| Micro Osmometer – Model 3300 | Advanced Instruments Inc. | S/N: 03050397P | |
| Parafilm Laboratory Wrapping Film | Fisher Scientific | 13-374-12 | |
| Petri dish | FALCON | SKU=351006 | ICSI/Biopsydish 50*9 mm |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | LONZA | 04-479Q | |
| Plasma Cleaner | Harrick plasma PDCOOL | NC0301989 | |
| Solidworks | Dassault Systemes | CAD software | |
| Sucrose | Fisher Scientific | 50-188-2419 | |
| Vacuum Desiccator | SPBEL-ART | F42400-2121 | |
| Wooden spatula | Fisher Scientific | NC0304136 | Tongue Depressors Wood NS 6" |
Riferimenti
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