Амплитудно-модулированная электродеформация для оценки механической усталости биологических клеток
Summary
Здесь представлен протокол испытаний на механическую усталость эритроцитов человека с использованием амплитудно-модулированного электродеформационного подхода. Этот общий подход может быть использован для измерения систематических изменений морфологических и биомеханических характеристик биологических клеток в суспензии от циклической деформации.
Abstract
Красные кровяные тельца (эритроциты) известны своей замечательной деформируемостью. Они многократно претерпевают значительную деформацию при прохождении через микроциркуляцию. Снижение деформируемости наблюдается у физиологически стареющих эритроцитов. Существующие методы измерения деформируемости клеток не могут быть легко использованы для измерения усталости, постепенной деградации клеточных мембран, вызванной циклическими нагрузками. Представлен протокол оценки механической деградации эритроцитов от циклических касательных напряжений с использованием электродеформации на основе модуляции амплитудного сдвига (ASK) в микрофлюидном канале. Вкратце, взаимосвязанные электроды в микрофлюидном канале возбуждаются переменным током низкого напряжения на радиочастотах с помощью генератора сигналов. Эритроциты во взвешенном состоянии реагируют на электрическое поле и проявляют положительный диэлектрофорез (ДЭП), который перемещает клетки к краям электродов. Затем ячейки растягиваются за счет электрических сил, действующих на две половинки ячейки, что приводит к одноосному растяжению, известному как электродеформация. Уровень напряжения сдвига и результирующей деформации можно легко регулировать, изменяя амплитуду волны возбуждения. Это позволяет количественно оценить нелинейную деформируемость эритроцитов в ответ на малые и большие деформации при высокой пропускной способности. Модификация волны возбуждения с помощью стратегии ASK индуцирует циклическую электродеформацию с программируемыми скоростями и частотами нагрузки. Это обеспечивает удобный способ определения усталости эритроцитов. Наш подход к электродеформации с ASK-модуляцией впервые позволяет напрямую измерять усталость эритроцитов от циклических нагрузок. Его можно использовать в качестве инструмента для общего биомеханического тестирования, для анализа деформируемости и усталости клеток в других типах клеток и при заболеваниях, а также можно комбинировать со стратегиями контроля микроокружения клеток, такими как напряжение кислорода и биологические и химические сигналы.
Introduction
Эритроциты (эритроциты) являются наиболее деформируемыми клетками в организме человека1. Их деформируемость напрямую связана с их кислородонесущей функцией. Было обнаружено, что снижение деформируемости эритроцитов коррелирует с патогенезом ряда нарушений эритроцитов2. Измерения деформируемости привели нас к лучшему пониманию заболеваний, связанных с эритроцитами3. Нормальная продолжительность жизни эритроцитов может варьироваться от 70 до 140дней4. Поэтому важно измерить, как их деформируемость уменьшается вместе с процессом старения, например, их усталостное поведение из-за циклических касательных напряжений3.
Измерение деформируемости эритроцитов при высокой производительности является сложной задачей из-за сил шкалы Пиконевтона (~10-12 Н), которые прикладываются к отдельным ячейкам. За последнее десятилетие было разработано множество технологий для измерениядеформируемости клеток5. Измерение деформации эритроцитов на уровне отдельных клеток может быть выполнено с помощью пипеточной аспирации и оптического пинцета, в то время как объемный анализ выполняется с помощью эктацитометрии с осмотическим градиентом. Эктацитометрические анализы дают обилие данных, что дает возможность диагностировать заболевания крови 6,7. Деформируемость эритроцитов также может быть проанализирована с помощью теории вязкоупругости с помощью коллоидной зондовой атомно-силовой микроскопии. В этом методе для оценки модуля упругости эритроцитов применяется вычислительный анализ, учитывающий как нестационарные, так и стационарные отклики. Деформируемость отдельных эритроцитов может быть измерена с помощью метода одноячеистой микрокамерной матрицы. Этот метод анализирует каждую клетку через мембранные и цитозольные флуоресцентные маркеры для получения информации о деформируемости эритроцитов и распределении клеточных характеристик в сложных популяциях эритроцитов для выявления гематологических нарушений8.
Усталость является ключевым фактором ухудшения свойств конструкционных материалов и биоматериалов. Усталостные испытания позволяют провести количественный анализ целостности и долговечности конструкции, подверженной циклическому нагружению. Анализ усталости в биологических клетках долгое время затруднялся отсутствием общего, легко применимого, высокопроизводительного и количественного метода реализации циклической деформации в клеточных мембранах. Это возможно благодаря использованию методов модуляции электрического сигнала и электродеформации, реализованных в микрофлюидной среде. Метод амплитудной манипуляции со сдвигом (ASK) в качестве цифровой модуляции применяется в этой статье с помощью модуляции On-Off (OOK). Концепция манипуляции относится к передаче цифровых сигналов по каналу, для функционирования которой требуется синусоидальный несущий сигнал9. Время включения и выключения может быть установлено равным. При ON-манипуляции эритроциты переходят в деформированное состояние под действием внешней силы электродеформации (Fdep)10 , создаваемой неоднородным электрическим полем. При выключении ключей эритроциты находятся в расслабленном состоянии. Мы наблюдаем усталость эритроцитов, а именно прогрессирующую деградацию их способности растягиваться с увеличением циклов нагружения. Вызванная усталостью потеря деформируемости эритроцитов может дать представление о накопленном повреждении мембран во время кровообращения, что позволит нам глубже исследовать связи между усталостью клеток и болезненными состояниями.
Здесь мы приводим пошаговые процедуры по проведению усталостных испытаний эритроцитов в микрофлюидном устройстве с помощью ASK-модулированной электродеформации и системных настроек, таких как микрофлюидное устройство, механическое нагружение и микроскопическое воображение для характеризации постепенной деградации механической деформируемости эритроцитов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Модуляция ASK OOK синусоиды, индуцирующей силу DEP, может быть использована для испытания механической усталости эритроцитов в течение длительного периода времени. В этом протоколе мы ограничили испытание на усталость in vitro 1 часом, чтобы предотвратить потенциальное неблагоприятное метаб?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было профинансировано NSF/CMMI Mechanobiology of Hemoglobin Based Artificial Oxygen Carrier (#1941655) и NSF/CMMI Dynamic and Fatigue Analysis of Healthy and Disease Red Blood Cells (#1635312).
Materials
| Balance Scale | ViBRA | HT-224R | |
| Bandpass filter | BRIGHTLINE | 414/46 BrightLine HC | |
| BD Disposable Syringes with Luer-Lok™ Tips, 1 mL | Fisher Scientific | 14-823-30 | |
| Biopsy Punches with Plunger System, 1.5 mm | Fisher Scientific | 12-460-403 | |
| Biopsy Punches with Plunger System, 3 mm | Fisher Scientific | 12-460-407 | 1.5 mm and 3 mm diameter |
| Blunt needle, 23-gauge | BSTEAN | X001308N97 | |
| Bovin Serum Albumin | RMBIO | BSA-BSH | |
| Centrifuge | SCILOGEX | 911015119999 | |
| Conical Tube, 50 mL | Fisher Scientific | 05-539-13 | |
| Dextrose | Fisher Scientific | MDX01455 | MilliporeSigma™ |
| EC Low Conductivity meter | ecoTestr | 358/03 | |
| Eppendorf Snap-Cap MicrocentrifugeTubes | www.eppendorf.com | 05-402-25 | |
| Excel | Microsoft | Graph plotting | |
| Function Generator | SIGLENT | SDG830 | |
| Glass/ITO Electrode Substrate | OSSILA | S161 | |
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Inverted Microscope | OLYMPUS | IX81 – SN9E07015 | |
| Lab Oven | QUINCY LAB (QL) | MODEL 30GCE | Digital Model |
| Matlab | MathWorks | Graph plotting | |
| Micro Osmometer – Model 3300 | Advanced Instruments Inc. | S/N: 03050397P | |
| Parafilm Laboratory Wrapping Film | Fisher Scientific | 13-374-12 | |
| Petri dish | FALCON | SKU=351006 | ICSI/Biopsydish 50*9 mm |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | LONZA | 04-479Q | |
| Plasma Cleaner | Harrick plasma PDCOOL | NC0301989 | |
| Solidworks | Dassault Systemes | CAD software | |
| Sucrose | Fisher Scientific | 50-188-2419 | |
| Vacuum Desiccator | SPBEL-ART | F42400-2121 | |
| Wooden spatula | Fisher Scientific | NC0304136 | Tongue Depressors Wood NS 6" |
Riferimenti
- Kim, Y., Kim, K., Park, Y. Measurement techniques for red blood cell deformability: recent advances. Blood Cell—An Overview of Studies in Hematology. 10, 167-194 (2012).
- Safeukui, I., et al. Quantitative assessment of sensing and sequestration of spherocytic erythrocytes by the human spleen. Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 120 (2), 424-430 (2012).
- Naghedi-Baghdar, H., et al. Effect of diet on blood viscosity in healthy humans: a systematic review. Electronic physician. 10 (3), 6563 (2018).
- Franco, R. S. Measurement of red cell lifespan and aging. Transfusion Medicine and Hemotherapy. 39 (5), 302-307 (2012).
- Matthews, K., Lamoureux, E. S., Myrand-Lapierre, M. -. E., Duffy, S. P., Ma, H. Technologies for measuring red blood cell deformability. Lab on a Chip. 22, 1254-1274 (2022).
- Kim, J., Lee, H., Shin, S. Advances in the measurement of red blood cell deformability: A brief review. Journal of Cellular Biotechnology. 1 (1), 63-79 (2015).
- Varga, A., Matrai, A. A., Barath, B., Deak, A., Horvath, L., Nemeth, N. Interspecies diversity of osmotic gradient deformability of red blood cells in human and seven vertebrate animal species. Cells. 11 (8), 1351 (2022).
- Doh, I., Lee, W. C., Cho, Y. -. H., Pisano, A. P., Kuypers, F. A. Deformation measurement of individual cells in large populations using a single-cell microchamber array chip. Applied Physics Letters. 100 (17), 173702 (2012).
- Al Safi, A., Bazuin, B. Toward digital transmitters with amplitude shift keying and quadrature amplitude modulators implementation examples. , 1-7 (2017).
- Zhang, J., Chen, K., Fan, Z. H. Circulating tumor cell isolation and analysis. Advances in Clinical Chemistry. 75, 1-31 (2016).
- Cottet, J., Fabregue, O., Berger, C., Buret, F., Renaud, P., Frénéa-Robin, M. MyDEP: a new computational tool for dielectric modeling of particles and cells. Biophysical Journal. 116 (1), 12-18 (2019).
- Haywood, M. Interpreting the full blood count. InnovAiT. 15 (3), 131-137 (2022).
- Qiang, Y., Liu, J., Dao, M., Suresh, S., Du, E. Mechanical fatigue of human red blood cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (40), 19828-19834 (2019).
- Gharaibeh, B., et al. Isolation of a slowly adhering cell fraction containing stem cells from murine skeletal muscle by the preplate technique. Nature Protocols. 3 (9), 1501-1509 (2008).
- Qiang, Y., Liu, J., Dao, M., Du, E. In vitro assay for single-cell characterization of impaired deformability in red blood cells under recurrent episodes of hypoxia. Lab on a Chip. 21 (18), 3458-3470 (2021).
