Amplitudmodulerad elektrodeformation för att utvärdera mekanisk utmattning av biologiska celler
Summary
Här presenteras ett protokoll för mekanisk utmattningstestning i fallet med humana röda blodkroppar med användning av en amplitudmodulerad elektrodeformationsmetod. Detta allmänna tillvägagångssätt kan användas för att mäta de systematiska förändringarna i morfologiska och biomekaniska egenskaper hos biologiska celler i en suspension från cyklisk deformation.
Abstract
Röda blodkroppar (RBC) är kända för sin anmärkningsvärda deformerbarhet. De genomgår upprepade gånger avsevärd deformation när de passerar genom mikrocirkulationen. Minskad deformerbarhet ses i fysiologiskt åldrade RBC. Befintliga tekniker för att mäta celldeformerbarhet kan inte enkelt användas för att mäta trötthet, den gradvisa nedbrytningen i cellmembran orsakad av cykliska belastningar. Vi presenterar ett protokoll för att utvärdera mekanisk nedbrytning i röda blodkroppar från cykliska skjuvspänningar med hjälp av ASK-modulationsbaserad elektrodeformation i en mikrofluidisk kanal. Kortfattat exciteras de interdigiterade elektroderna i mikrofluidikkanalen med en lågspänningsväxelström vid radiofrekvenser med hjälp av en signalgenerator. RBC i suspension svarar på det elektriska fältet och uppvisar positiv dielektrofores (DEP), som flyttar celler till elektrodkanterna. Cellerna sträcks sedan på grund av de elektriska krafter som utövas på de två cellhalvorna, vilket resulterar i enaxlig sträckning, känd som elektrodeformation. Nivån på skjuvspänningen och den resulterande deformationen kan enkelt justeras genom att ändra amplituden för excitationsvågen. Detta möjliggör kvantifieringar av olinjär deformerbarhet av röda blodkroppar som svar på små och stora deformationer vid hög genomströmning. Modifiering av excitationsvågen med ASK-strategin inducerar cyklisk elektrodeformation med programmerbara belastningshastigheter och frekvenser. Detta ger ett bekvämt sätt för karakterisering av RBC-trötthet. Vår ASK-modulerade elektrodeformationsmetod möjliggör för första gången en direkt mätning av RBC-utmattning från cykliska belastningar. Det kan användas som ett verktyg för allmän biomekanisk testning, för analyser av celldeformerbarhet och trötthet i andra celltyper och sjukdomstillstånd, och kan också kombineras med strategier för att kontrollera cellernas mikromiljö, såsom syrespänning och biologiska och kemiska signaler.
Introduction
Röda blodkroppar (RBC) är de mest deformerbara cellerna i människokroppen1. Deras deformerbarhet är direkt relaterad till deras syrebärande funktionalitet. Minskad deformerbarhet i RBC har visat sig korrelera med patogenesen av flera RBC-störningar2. Deformerbarhetsmätningar har lett oss till en bättre förståelse av RBC-relaterade sjukdomar3. Den normala livslängden för RBC kan variera från 70 till 140 dag4. Därför är det viktigt att mäta hur deras deformerbarhet minskar tillsammans med åldringsprocessen, t.ex. deras utmattningsbeteende på grund av cykliska skjuvspänningar3.
Att mäta RBC-deformerbarhet vid hög genomströmning är utmanande på grund av piconewton-skalkrafterna (~ 10-12 N) som appliceras på de enskilda cellerna. Under det senaste decenniet har många tekniker utvecklats för att mäta celldeformerbarhet5. Deformationsmätningar av röda blodkroppar på encellsnivå kan utföras med pipettaspiration och optisk pincett, medan bulkanalyser görs med osmotisk gradientektacytometri. Ektacytometrianalyser ger ett överflöd av data, vilket ger möjlighet att diagnostisera blodsjukdomar 6,7. Deformerbarheten hos röda blodkroppar kan också analyseras med hjälp av den viskoelastiska teorin genom kolloidsond atomkraftmikroskopi. I denna metod tillämpas beräkningsanalys för att uppskatta den elastiska modulen för RBC, med hänsyn till både tidsberoende och steady-state-svar. Deformerbarheten hos enskilda röda blodkroppar kan mätas med hjälp av encellsmetoden med mikrokammarmatris. Denna metod analyserar varje cell genom membranet och cytosoliska fluorescerande markörer för att ge information om RBC-deformerbarhet och fördelningen av cellulära egenskaper i komplexa RBC-populationer för att detektera hematologiska störningar8.
Utmattning är en nyckelfaktor i nedbrytningen av egenskaper hos konstruerade material och biomaterial. Utmattningsprovning möjliggör en kvantitativ analys av integriteten och livslängden hos en struktur som utsätts för cyklisk belastning. Analys av utmattning i biologiska celler har länge försvårats av avsaknaden av en allmän, lätt tillämpbar, hög genomströmning och kvantitativ metod för implementering av cyklisk deformation i cellmembran. Detta är möjligt med användning av elektrisk signalmodulering och elektrodeformationstekniker implementerade i en mikrofluidisk miljö. Amplitudskiftnyckeltekniken (ASK) som en digital modulering tillämpas genom OOK-modulering (On-Off keying) i den här artikeln. Begreppet keying avser överföring av digitala signaler över kanalen, vilket kräver en sinusvågbärarsignal för att fungera9. PÅ- och AV-tiderna kan ställas in lika. Under ON-keying går RBC in i ett deformerat tillstånd medan de utsätts för en extern elektrodeformationskraft (Fdep)10 skapad av det ojämna elektriska fältet. Under OFF-keying är RBC: er i sitt avslappnade tillstånd. Vi observerar tröttheten hos röda blodkroppar, nämligen en progressiv försämring av deras förmåga att sträcka sig med ökande belastningscykler. Den trötthetsinducerade deformerbarhetsförlusten i röda blodkroppar kan ge insikter om den ackumulerade membranskadan under blodcirkulationen, vilket gör det möjligt för oss att ytterligare undersöka sambanden mellan celltrötthet och sjukdomstillstånd.
Här tillhandahåller vi steg-för-steg-procedurer för hur utmattningstestning av RBC implementeras i en mikrofluidisk enhet via ASK-modulerad elektrodeformation och systeminställningarna såsom mikrofluidisk anordning, mekanisk belastning och mikroskopisk föreställning för karakterisering av den gradvisa nedbrytningen i mekanisk deformerbarhet av RBC.
Protocol
Representative Results
Discussion
ASK OOK-moduleringen av en DEP-kraftinducerande sinusvåg kan användas för att testa den mekaniska utmattningen hos RBC under en lång tidsperiod. I detta protokoll begränsade vi in vitro-utmattningstestningen till 1 timme för att förhindra de potentiella negativa metaboliska effekterna på celldeformerbarheten. Omfattande utmattningstestförhållanden kan programmeras med hjälp av ASK-modulerad elektrodeformationsteknik. Parametrar som laddningsfrekvens, amplitud och laddningshastighet kan alla programmeras. Lastf…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna forskning har finansierats av NSF / CMMI Mechanobiology of Hemoglobin-Based Artificial Oxygen Carriers (# 1941655) och NSF / CMMI Dynamic and Fatigue Analysis of Healthy and Diseased Red Blood Cells (#1635312).
Materials
| Balance Scale | ViBRA | HT-224R | |
| Bandpass filter | BRIGHTLINE | 414/46 BrightLine HC | |
| BD Disposable Syringes with Luer-Lok™ Tips, 1 mL | Fisher Scientific | 14-823-30 | |
| Biopsy Punches with Plunger System, 1.5 mm | Fisher Scientific | 12-460-403 | |
| Biopsy Punches with Plunger System, 3 mm | Fisher Scientific | 12-460-407 | 1.5 mm and 3 mm diameter |
| Blunt needle, 23-gauge | BSTEAN | X001308N97 | |
| Bovin Serum Albumin | RMBIO | BSA-BSH | |
| Centrifuge | SCILOGEX | 911015119999 | |
| Conical Tube, 50 mL | Fisher Scientific | 05-539-13 | |
| Dextrose | Fisher Scientific | MDX01455 | MilliporeSigma™ |
| EC Low Conductivity meter | ecoTestr | 358/03 | |
| Eppendorf Snap-Cap MicrocentrifugeTubes | www.eppendorf.com | 05-402-25 | |
| Excel | Microsoft | Graph plotting | |
| Function Generator | SIGLENT | SDG830 | |
| Glass/ITO Electrode Substrate | OSSILA | S161 | |
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Inverted Microscope | OLYMPUS | IX81 – SN9E07015 | |
| Lab Oven | QUINCY LAB (QL) | MODEL 30GCE | Digital Model |
| Matlab | MathWorks | Graph plotting | |
| Micro Osmometer – Model 3300 | Advanced Instruments Inc. | S/N: 03050397P | |
| Parafilm Laboratory Wrapping Film | Fisher Scientific | 13-374-12 | |
| Petri dish | FALCON | SKU=351006 | ICSI/Biopsydish 50*9 mm |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | LONZA | 04-479Q | |
| Plasma Cleaner | Harrick plasma PDCOOL | NC0301989 | |
| Solidworks | Dassault Systemes | CAD software | |
| Sucrose | Fisher Scientific | 50-188-2419 | |
| Vacuum Desiccator | SPBEL-ART | F42400-2121 | |
| Wooden spatula | Fisher Scientific | NC0304136 | Tongue Depressors Wood NS 6" |
Riferimenti
- Kim, Y., Kim, K., Park, Y. Measurement techniques for red blood cell deformability: recent advances. Blood Cell—An Overview of Studies in Hematology. 10, 167-194 (2012).
- Safeukui, I., et al. Quantitative assessment of sensing and sequestration of spherocytic erythrocytes by the human spleen. Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 120 (2), 424-430 (2012).
- Naghedi-Baghdar, H., et al. Effect of diet on blood viscosity in healthy humans: a systematic review. Electronic physician. 10 (3), 6563 (2018).
- Franco, R. S. Measurement of red cell lifespan and aging. Transfusion Medicine and Hemotherapy. 39 (5), 302-307 (2012).
- Matthews, K., Lamoureux, E. S., Myrand-Lapierre, M. -. E., Duffy, S. P., Ma, H. Technologies for measuring red blood cell deformability. Lab on a Chip. 22, 1254-1274 (2022).
- Kim, J., Lee, H., Shin, S. Advances in the measurement of red blood cell deformability: A brief review. Journal of Cellular Biotechnology. 1 (1), 63-79 (2015).
- Varga, A., Matrai, A. A., Barath, B., Deak, A., Horvath, L., Nemeth, N. Interspecies diversity of osmotic gradient deformability of red blood cells in human and seven vertebrate animal species. Cells. 11 (8), 1351 (2022).
- Doh, I., Lee, W. C., Cho, Y. -. H., Pisano, A. P., Kuypers, F. A. Deformation measurement of individual cells in large populations using a single-cell microchamber array chip. Applied Physics Letters. 100 (17), 173702 (2012).
- Al Safi, A., Bazuin, B. Toward digital transmitters with amplitude shift keying and quadrature amplitude modulators implementation examples. , 1-7 (2017).
- Zhang, J., Chen, K., Fan, Z. H. Circulating tumor cell isolation and analysis. Advances in Clinical Chemistry. 75, 1-31 (2016).
- Cottet, J., Fabregue, O., Berger, C., Buret, F., Renaud, P., Frénéa-Robin, M. MyDEP: a new computational tool for dielectric modeling of particles and cells. Biophysical Journal. 116 (1), 12-18 (2019).
- Haywood, M. Interpreting the full blood count. InnovAiT. 15 (3), 131-137 (2022).
- Qiang, Y., Liu, J., Dao, M., Suresh, S., Du, E. Mechanical fatigue of human red blood cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (40), 19828-19834 (2019).
- Gharaibeh, B., et al. Isolation of a slowly adhering cell fraction containing stem cells from murine skeletal muscle by the preplate technique. Nature Protocols. 3 (9), 1501-1509 (2008).
- Qiang, Y., Liu, J., Dao, M., Du, E. In vitro assay for single-cell characterization of impaired deformability in red blood cells under recurrent episodes of hypoxia. Lab on a Chip. 21 (18), 3458-3470 (2021).
