Summary
Dieses Manuskript skizziert ein detailliertes Videoprotokoll für die Kultivierung von primären Linsenepithelzellen (LECs), das darauf abzielt, die Reproduzierbarkeit zu verbessern und die Forschung bei Katarakten und hinterer Kapseltrübung (PCO) zu unterstützen. Es bietet Schritt-für-Schritt-Anleitungen zur Linsendissektion, LECs-Isolierung und Validierung und dient insbesondere für Neueinsteiger auf diesem Gebiet als wertvoller Leitfaden.
Abstract
Linsenepithelzellen (LECs) spielen mehrere wichtige Rollen bei der Aufrechterhaltung der Homöostase und der normalen Funktion der Linse. LECs bestimmen das Wachstum, die Entwicklung, die Größe und die Transparenz von Linsen. Umgekehrt können dysfunktionale LECs zur Kataraktbildung und zur Trübung der hinteren Kapsel (PCO) führen. Daher ist die Etablierung eines robusten primären LEC-Kultursystems für Forscher wichtig, die sich mit Linsenentwicklung, Biochemie, Katarakttherapeutika und PCO-Prävention befassen. Der Anbau von primären LECs stellt jedoch aufgrund ihrer begrenzten Verfügbarkeit, langsamen Proliferationsrate und empfindlichen Natur seit langem eine Herausforderung dar.
Diese Studie befasst sich mit diesen Hürden, indem sie ein umfassendes Protokoll für die primäre LEC-Kultur vorstellt. Das Protokoll umfasst wesentliche Schritte wie die Formulierung eines optimierten Nährmediums, die präzise Isolierung von Linsenkapseln, Trypsinisierungstechniken, Subkulturverfahren, Ernteprotokolle sowie Richtlinien für Lagerung und Versand. Während des gesamten Kulturprozesses wurde die Zellmorphologie mit Hilfe der Phasenkontrastmikroskopie überwacht.
Um die Authentizität der kultivierten LECs zu bestätigen, wurden Immunfluoreszenz-Assays durchgeführt, um das Vorhandensein und die subzelluläre Verteilung kritischer Linsenproteine, nämlich αA- und γ-Kristalline, nachzuweisen. Dieses detaillierte Protokoll stattet Forscher mit einer wertvollen Ressource für die Kultivierung und Charakterisierung primärer LECs aus und ermöglicht Fortschritte in unserem Verständnis der Linsenbiologie und der Entwicklung therapeutischer Strategien für linsenbedingte Erkrankungen.
Introduction
Die Augenlinse spielt eine entscheidende Rolle beim Sehen, indem sie das einfallende Licht auf die Netzhaut fokussiert. Es besteht aus einer transparenten, avaskulären Struktur, die aus spezialisierten Zellen besteht, unter denen Linsenepithelzellen (LECs) eine Schlüsselrolle spielen. LECs befinden sich an der vorderen Oberfläche der Linse und sind für die Aufrechterhaltung ihrer Transparenz, die Regulierung des Wasserhaushalts und die Teilnahme am Wachstum und der Entwicklung der Linseverantwortlich 1,2. LECs sind eine einzigartige Art von Zellen, die sich im vorderen Teil der Linse befinden und eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der Klarheit und Funktion der Linse spielen, indem sie während des gesamten Lebens kontinuierlich Linsenfasern produzieren.
Katarakte sind durch eine fortschreitende Trübung der Linse gekennzeichnet, die zu einer Verzerrung und Streuung des Lichts führt, was zu einer Beeinträchtigung des Sehvermögens führt 3,4. Die genauen Mechanismen, die der Kataraktbildung zugrunde liegen, sind komplex und multifaktoriell und umfassen verschiedene zelluläre und molekulare Prozesse wie UV-Strahlung, oxidative Schäden und Glykation 5,6. Es wurde festgestellt, dass LECs erheblich zur Entwicklung von Katarakten beitragen, was sie zu einem wichtigen Forschungsschwerpunkt macht 1,2,7,8,9.
Darüber hinaus ist eines der drängendsten Probleme in der heutigen Augenheilkunde die relativ hohe Inzidenz der hinteren Kapseltrübung (PCO), auch bekannt als sekundärer Katarakt. PCO ist nach wie vor die häufigste Komplikation nach Kataraktoperationen und betrifft bis zu 20-40% der erwachsenen Patienten und 100% der Kinder innerhalb von 5 Jahren nach der Operation10. PCO wird hauptsächlich durch die verbleibenden LECs verursacht, die nach der Kataraktextraktion im Kapselsack verbleiben. Diese Zellen durchlaufen eine facettenreiche pathophysiologische Transformation, die nicht nur den Übergang von Epithel zu Mesenchym (EMT), sondern auch die Differenzierung von LECs zu Linsenfasern umfasst, was zu einer Zellpopulation führt, die eine Mischung aus LECs, Fasern und Myofibroblasten ist 11,12,13. Die transformierten Zellen vermehren sich und wandern durch die hintere Linsenkapsel, was zu Sehstörungen führt. Das Verständnis des Verhaltens und der Kontrollmechanismen von LECs in Kulturmodellen kann wertvolle Einblicke in die Prävention und das Management von PCO liefern. Daher stellt dieses Protokoll zur Kultivierung von LECs ein wichtiges Werkzeug für Augenforscher dar, die darauf abzielen, diese weit verbreitete postoperative Komplikation zu untersuchen, zu verstehen und letztendlich zu bekämpfen.
Um die Feinheiten der LEC-Biologie und ihre Rolle bei der Kataraktbildung und PCO zu entschlüsseln, ist es wichtig, robuste und reproduzierbare In-vitro-Primärzellkultursysteme zu etablieren. Die primäre LEC-Kultur bietet Forschern eine kontrollierte Umgebung, um die Funktionen, Signalwege und molekularen Eigenschaften von LECs zu untersuchen. Darüber hinaus ermöglicht es die Untersuchung zellulärer Prozesse und der Auswirkungen verschiedener experimenteller Bedingungen und liefert wertvolle Einblicke in die Linsenphysiologie und -pathologie.
Frühere Forschungen haben unser Verständnis der LEC-Kulturtechniken bereichert 14,15,16,17,18,19,20. Obwohl diese Studien verschiedene Methoden angewendet und signifikante Erkenntnisse über das Verhalten und die Eigenschaften von LECs geliefert haben, fehlt in der aktuellen Literatur ein umfassendes und zugängliches Videoaufzeichnungsprotokoll für die Kultivierung von LECs. Diese Einschränkung kann die Fähigkeit von Anfängern behindern, die Techniken genau zu reproduzieren, und kann zu Inkonsistenzen und Abweichungen in den experimentellen Ergebnissen führen. Durch die Bereitstellung eines Videoaufzeichnungsprotokolls zielt diese Forschungsarbeit darauf ab, diese Lücke zu schließen und eine standardisierte Ressource bereitzustellen, die die Reproduzierbarkeit verbessern und den Wissenstransfer im Bereich der LEC-Kultur erleichtern kann.
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Protocol
Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien der Association for Research in Vision and Ophthalmology für die Verwendung von Tieren in der Augen- und Sehforschung durchgeführt. Die Verfahrensgenehmigung wurde vom Animal Care and Use Committee des Health Science Center der University of North Texas erteilt (Protokollnummer: IACUC-2022-0008). In diesen Studien wurden junge C57BL/6J-Mäuse verwendet, die in der Regel unter 2 Wochen alt waren.
1. Nährmediumvorbereitung und Linsendissektion
- Bereiten Sie das Kulturmedium vor, indem Sie 50 ml fötales Kälberserum (FBS) und 0,1 ml 50 mg/ml Gentamicin zu 450 ml DMEM hinzufügen.
- C57BL/6J-Mäuse, die jünger als 2 Wochen sind, human einschläfern.
HINWEIS: Wir euthanasierten mit der CO2 - Inhalationsmethode. Eine optimale Durchflussrate für CO2 -Euthanasiesysteme sollte 30 % bis 70 % des Kammer- oder Käfigvolumens/min verdrängen. - Entfernen Sie die Augenlider vorsichtig mit einer chirurgischen Schere und üben Sie mit einer gebogenen Pinzette leichten Druck auf gegenüberliegende Seiten der Augenhöhle aus, wodurch das Auge nach außen ragt. Machen Sie mit dem Kataraktmesser einen vorsichtigen Schnitt in der Hornhaut und ziehen Sie die Linse vorsichtig mit einer gebogenen Pinzette heraus, um sicherzustellen, dass die Linse oder ihre Kapsel nicht beschädigt werden.
HINWEIS: Seien Sie vorsichtig, wenn Sie diese Schritte ausführen, um die Integrität der Objektivkapsel zu erhalten. Aufgrund der empfindlichen Beschaffenheit der Linse ist es wichtig, Präparierwerkzeuge mit gebogenen und stumpfen Spitzen zu verwenden, um das Risiko einer Linsenbeschädigung zu minimieren. - Verwenden Sie eine gebogene Pinzette mit stumpfen Spitzen, um die Linsen in eine 60-mm-Kunststoff-Gewebekulturschale zu geben, die mit 5 ml vorgewärmter und steriler Dulbecco-Lösung mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (DPBS) gefüllt ist, die 10 μg/ml Gentamicin enthält.
- Spülen Sie die Linsen vorsichtig mit DPBS-Lösung mit 10 μg/ml Gentamicin ab, um mögliche Ablagerungen oder Verunreinigungen zu entfernen, die Linsen für die weitere Verarbeitung vorzubereiten und eine sterile Kulturumgebung aufrechtzuerhalten.
- Um eine ausreichende Anzahl von LECs zu erhalten, werden vier Linsen für eine 24-Well-Kulturplatte und sechs Linsen für eine 6-Well-Kulturplatte gepoolt.
2. Isolierung von LECs
- Legen Sie die Linse nach Abschluss des Spülvorgangs auf ein Stück Filterpapier und lassen Sie sie trocknen.
- Sobald die Linse ausreichend trocken ist, legen Sie sie vorsichtig auf die Abdeckung einer Petrischale, um die Entfernung der Linsenkapsel vorzubereiten.
- Drehen Sie die Linse nach oben und stellen Sie sicher, dass der vordere Augenabschnitt nach oben zeigt. Während Sie die vordere Kapsel mit der Pinzette halten, verwenden Sie die Kapselzange in der dominanten Hand, um einen kleinen Riss in der Kapsel zu erzeugen. Ziehen Sie die beiden Werkzeuge vorsichtig in entgegengesetzte Richtungen, um die Kapsel zu entfernen, und legen Sie sie in DPBS, bis alle Linsendissektionen abgeschlossen sind.
HINWEIS: Um Unstimmigkeiten zu vermeiden, sollten Forscher jede Linsenepithelkapsel umgehend sezieren und vorübergehend in DPBS lagern. Erst nach Abschluss aller Dissektionen werden die Kapseln kollektiv auf Trypsin überführt, das bei 37 °C gehalten wird, um eine synchronisierte und gleichmäßige Exposition zu gewährleisten. - Übertragen Sie die Linsenkapsel vorsichtig auf eine 6-Well-Platte. Geben Sie 1 ml 0,05%ige Trypsinlösung in jede Vertiefung, um den enzymatischen Verdauungsprozess einzuleiten.
- Rühren Sie die Trypsinlösung vorsichtig um, um eine gleichmäßige Permeation zu gewährleisten. Stellen Sie die Platte in einen Zellkultur-Inkubator und lassen Sie die Kapsel 8-10 min bei 37 °C verdauen.
HINWEIS: Dieser Schritt erleichtert den Abbau des Linsenkapselgewebes und die anschließende Freisetzung einzelner Epithelzellen. - Nach der Inkubation die verdaute Linsenkapsel vorsichtig mit einer Präparierschere zerkleinern, um verbleibende Gewebeklumpen aufzubrechen und die Zelltrennung zu fördern.
HINWEIS: Die Gründlichkeit beim Zerkleinern des Gewebes wird betont, um eine effiziente Zellfreisetzung aus den verdauten Linsenkapseln zu gewährleisten. - Fügen Sie 0,5 ml des Kulturmediums mit 10 % FBS hinzu, um das Trypsin abzuschrecken. Geben Sie die Gewebeproben in ein Zentrifugationsröhrchen und zentrifugieren Sie sie bei 1.000 × g für 5 min.
- Entfernen Sie vorsichtig den Überstand, ohne das Zellpellet zu stören. Verwenden Sie 1 ml Kulturmedium, um die Zellen zu resuspendieren und die Zellen in einer 24-Well-Platte zu säen.
- Wechseln Sie das Nährmedium alle 2-3 Tage.
3. LECs-Subkultur
- Sobald die Zellen zusammenfließen, entfernen Sie das Medium aus der Kulturschale. Waschen Sie die Zellen 2x mit 1 ml DPBS.
- Fügen Sie 200 μl Trypsin-EDTA-Lösung hinzu und legen Sie die Zellen für 5 Minuten in den Inkubator.
- Nehmen Sie die Zellen nach der Inkubation aus dem Inkubator und untersuchen Sie sie unter einem Mikroskop, um sicherzustellen, dass sie sich von der Kulturschale gelöst haben und zu schwimmen beginnen.
- Fügen Sie 1 ml Kulturmedium hinzu und pipettieren Sie die Zellen vorsichtig 3-5x, um alle Zellen zu lösen.
- Die Zellen in Zentrifugenröhrchen umfüllen und bei 1.000 × g 5 min zentrifugieren.
- Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen im vollständigen Wachstumsmedium.
- Zählen Sie bei Bedarf die Zellzahl mit einem Hämozytometer.
- Unterteilen Sie die Zellsuspension im Verhältnis 1:2 oder 1:3 für Subkulturzwecke.
- Wenn die Kultur wieder zusammenfließt, wiederholen Sie die oben genannten Verfahren.
HINWEIS: LECs gedeihen unter Kulturbedingungen mit hoher Dichte. Vermeiden Sie es, die Zellen übermäßig zu verdünnen, da dies ihr Wachstum behindern kann.
4. Lagerung und Versand
HINWEIS: Die ideale Zellennummer für die Speicherung ist ~1 × 106.
- Waschen Sie die Zellen 3x gründlich mit 1 ml DPBS. Nach dem Waschen 1 ml Trypsin-EDTA-Lösung hinzufügen und die Zellen für 5 Minuten in den Inkubator legen.
- Fügen Sie 2 ml vollständiges Kulturmedium hinzu und geben Sie die Zellsuspension in das Zentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie 5 Minuten lang bei 1.000 × g .
- Der Überstand wird verworfen und die Zellen werden in einem Gefriermedium aus 90 % FBS und 10 % DMSO resuspendiert, wobei eine Zelldichte von 1 × 106 Zellen/ml angestrebt wird. Übertragen Sie die Zellsuspension in das Kryofläschchen.
- Bringen Sie die Zellen sofort für 1 h in eine Umgebung von -20 °C, gefolgt von -80 °C über Nacht, bevor Sie sie dauerhaft in flüssigem Stickstoff lagern.
HINWEIS: Wenn kein flüssiger Stickstoff verfügbar ist, können die Zellen nach einer ersten Stunde bei -20 °C bei -80 °C gelagert werden. - Wenn eine Sendung erforderlich ist, versenden Sie die Zellen im Kryofläschchen in einem Paket mit Trockeneis für die Lieferung über Nacht.
- Stellen Sie nach Erhalt der Zellen eine schnelle Genesung sicher und legen Sie die Zellen in die Subkultur. Wenn eine sofortige Kultur nicht möglich ist, übertragen Sie die Zellen zur längeren Lagerung in flüssigen Stickstoff.
HINWEIS: Wenn die Zellen versendet werden sollen, stellen Sie sicher, dass die Proben tief im Trockeneis vergraben sind, um mögliche Schäden durch Temperaturschwankungen zu vermeiden.
5. LECs-Validierung
- LECs in 35-mm-Kulturschalen mit abgedeckten Gläsern anrichten und ca. 48 h kultivieren.
- Waschen Sie die Zellen 2x mit PBS und fixieren Sie die Zellen mit kaltem Methanol für 10 min bei -20 °C.
- Waschen Sie die fixierten Zellen 3 x 5 min lang mit PBS und inkubieren Sie die fixierten Zellen mit Blockierungspuffer für 1 h bei Raumtemperatur, um eine unspezifische Bindung zu vermeiden.
- Nach der Blockierung werden die Zellen über Nacht bei 4 °C inkubiert, wobei die Primärantikörper (αA-Kristallin-, γ-Kristallin- und PROX1-Antikörper) einzeln im Verhältnis 1:50 in Verdünnungspuffer verdünnt werden.
- Waschen Sie die Zellen 3 x 5 min lang mit PBS und inkubieren Sie die Zellen mit dem 1:100 in Verdünnungspuffer verdünnten Sekundärantikörper 1 h lang.
- Waschen Sie die Zellen 3 x 5 min mit PBS und färben Sie die Zellen mit 5 μg/mL Hoechst 33342 in PBS für 10 min bei Raumtemperatur, um die Zellkerne sichtbar zu machen.
- Waschen Sie die Zellen 2 x 5 Minuten lang mit PBS, um überschüssige Färbelösung zu entfernen, und nehmen Sie Fluoreszenzbilder der Zellen mit einem Fluoreszenzmikroskop unter Verwendung des DAPI-Kanals für Zellkerne und des FITC-Kanals für αA-, γ-Kristalline und PROX1 auf.
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Representative Results
Wie in Abbildung 2 gezeigt, hafteten die primären LECs von C57BL/6J-Mäusen innerhalb eines Zeitraums von 4 Stunden an den Schüsseln. Insbesondere gab es sichtbare Überreste anderer Gewebe wie Abschnitte der hinteren Kapsel und Linsenfaserzellen. Diese unbeabsichtigten Elemente hafteten jedoch nicht an der Schale und konnten daher durch einen Wechsel des Nährmediums entfernt werden. Anschließend, zwischen dem dritten und fünften Tag, leiteten die LECs ihre Proliferationsphase ein. Zwischen dem siebten und zehnten Tag konnte dann ein schnelles Wachstum beobachtet werden, das für die logarithmische Proliferationsphase charakteristisch ist. In Fällen, in denen die Zellen nicht in die schnelle Wachstumsphase übergehen, kann es ratsam sein, Wachstumsergänzungen wie EpiCGS-a in das Kulturmedium einzuarbeiten. Darüber hinaus beobachteten wir, dass Zellen in dem Medium, das 20% FBS enthält, eine schnellere Wachstumsrate aufweisen als in 10% FBS. Eine niedrigere FBS-Konzentration fördert in der Regel ein langsameres Wachstum und spiegelt die Merkmale des zentralen Epithels der Linse wider, während eine FBS-Konzentration von 20 % die Eigenschaften der proliferativen Zone der Linse nachbildet.
Laut Reddy et al. und Andley et al., die die immortalisierte humane Linsenepithelzelllinie B3 entwickelt haben, wird erwartet, dass LECs verschiedene linsenspezifische Proteine wie αA- und γ-Kristallineexprimieren sollten 2,21. Daher haben wir in dieser Studie αA- und γ-Kristalline als zelluläre Marker verwendet, um die Identität der Zellen als LECs zu validieren. LECs innerhalb der ersten drei Passagen wurden auf Glasdeckgläsern kultiviert. Die primären Antikörper, die spezifisch für αA- und γ-Kristalline sind, wurden verwendet, um die Zellen über Nacht zu inkubieren. Wie in Abbildung 3 gezeigt, zeigten diese Zellen eine robuste Expression von αA- und γ-Kristallinen, was den endgültigen Beweis dafür liefert, dass es sich um von Linsen abgeleitete Epithelzellen handelt. Darüber hinaus verwendeten wir PROX1 als etablierten Marker für Faserzellen, um die primären LECs zu markieren. Die Daten zeigten, dass diese LECs eine negative Färbung für PROX1 zeigten, was bestätigt, dass es sich bei diesen Zellen um Epithelzellen handelt, die noch nicht zu Faserzellen differenziert wurden.
Abbildung 1: Schritt-für-Schritt-Workflow für die LEC-Kultur. Die Abbildung zeigt die aufeinanderfolgenden Schritte bei der Kultivierung von primären Linsenepithelzellen. Schritt 1 besteht darin, einen kleinen Riss in der vorderen Kapsel zu erzeugen. Schritt 2 beinhaltet das vorsichtige Entfernen der Linsenkapsel. In Schritt 3 wird die Linsenkapsel vorsichtig auf eine 24-Well-Platte überführt und 10 Minuten lang mit 0,05%iger Trypsinlösung bei 37 °C inkubiert. Nach der Inkubation wird die verdaute Linsenkapsel mit einer Präparierschere zerkleinert, um die Zelltrennung zu fördern. Schritt 4 beinhaltet das Abschrecken des Trypsins durch Zugabe von 0,5 ml Kulturmedium mit 20 % FBS in das Zentrifugationsröhrchen und das Zentrifugieren der Gewebeproben bei 1.000 × g für 5 Minuten. Schritt 5 erfordert die Resuspendierung der Zellen in 1 ml Kulturmedium und die Aussaat in einer 24-Well-Platte. In Schritt 6 schließlich werden die Nährmedien alle 2-3 Tage gewechselt, um das Zellwachstum und die Zellerhaltung während des gesamten Experiments zu unterstützen. Abkürzungen: LECs = Linsenepithelzellen; FBS = fötales Rinderserum. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Wachstumsmuster von LECs im Laufe der Zeit. Die morphologischen Veränderungen der primären Linsenepithelzellen zu verschiedenen Zeitpunkten während ihres Wachstums wurden unter einem Phasenkontrastmikroskop aufgezeichnet. Die an den Tagen 1, 2, 3, 5, 7 und 10 aufgenommenen Bilder zeigen die sich entwickelnde Zellmorphologie und geben Einblick in die Entwicklung und das Verhalten von Linsenepithelzellen im Laufe der Zeit. Roter Pfeil, der die Position der aktiv proliferierenden Linsenepithelzellen anzeigt. Maßstabsleisten = 100 μm. Abkürzung: LECs = Linsenepithelzellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Validierung von LECs. (A) Immunfärbung von αA-Kristallin in Maus-LECs. Primäre mLECs wurden mit Hoechst 33342 (blau) und αA-Crystallin-Antikörper (grün) gefärbt. (B) Immunfärbung von γ-Crystallin in Maus-LECs. (C) Immunfärbung von PROX1 in Maus-LECs. Primäre mLECs wurden mit Hoechst 33342 (blau) und PROX1-Antikörpern (grün) gefärbt. Maßstabsleisten = 50 μm. Abkürzung: LECs = Linsenepithelzellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Das in diesem Dokument vorgestellte Protokoll bietet eine umfassende Schritt-für-Schritt-Anleitung für die erfolgreiche Isolierung, Kultur und Subkultur von primären LECs, komplett mit begleitender Videodokumentation. Der detaillierte visuelle Leitfaden neben den schriftlichen Anweisungen verbessert die Klarheit und Zugänglichkeit des Protokolls und fördert seine Verwendung und Reproduzierbarkeit bei Forschern auf diesem Gebiet. Das ultimative Ziel ist es, zum wachsenden Wissen über die Rolle von LECs bei der Kataraktbildung und PCO, einer weit verbreiteten Komplikation nach Kataraktoperationen, beizutragen.
Beim Vergleich von primären LECs mit Linsenepithelzelllinien wie HLE-B3 und SRA01/04 bietet jede einzigartige Vorteile und Herausforderungen im Forschungskontext. Die HLE-B3-Zelllinie repräsentiert zusammen mit der SRA01/04 eine Kategorie von Zelllinien, die zwar einfach zu handhaben und langlebig sind, aber aufgrund ihrer kontinuierlichen Replikation und verlängerten Kulturbedingungen häufig genetische und phänotypische Veränderungen aufweisen. Dies kann zu erheblichen Abweichungen von der Funktion der ursprünglichen LECs führen und dadurch die Authentizität ihrer Antworten verringern. Umgekehrt spiegeln primäre LECs, die direkt aus lebendem Gewebe von Patienten oder Versuchstieren isoliert werden, die natürliche zelluläre Umgebung und die inhärenten Reaktionen der Linse in vivo genauer wider. Trotz der zusätzlichen Komplexität ihrer Extraktion und Kultur werden sie oft in Studien bevorzugt, die eine hohe physiologische Relevanz erfordern, da sie genauere und zuverlässigere Ergebnisse liefern.
Bei der Befolgung dieses Protokolls müssen einige wichtige Punkte beachtet werden. In diesen Studien wurden junge C57BL/6J-Mäuse verwendet, die in der Regel unter 2 Wochen alt waren. Wir beobachteten, dass LECs, die von diesen jungen Mäusen geerntet wurden, ein kräftigeres Wachstum zeigten als LECs von Mäusen, die 2 Monate oder älter waren. Dies deutet auf eine negative Korrelation zwischen dem Alter der Mäuse und dem Zellwachstum hin.
Das Sezieren der Linse aus einem Mausauge ist eine heikle Aufgabe, die den sorgfältigen Einsatz von Präparierwerkzeugen erfordert, um die Integrität der Linse und ihrer Kapsel zu erhalten. Das in Protokollabschnitt 1 beschriebene Verfahren stellt sicher, dass die Linse mit minimaler Beschädigung erfolgreich extrahiert wird. Während die Aufrechterhaltung der Gesundheit und Integrität der Linsenkapsel eine Herausforderung darstellt, kann ihre Bedeutung nicht unterschätzt werden, da jede Beschädigung möglicherweise die Qualität und Quantität der isolierten LECs beeinträchtigen könnte. Es ist bemerkenswert, dass die Mehrheit der Zellteilungen typischerweise in der Keimzone in der Nähe der Äquatorregion in der Linse stattfindet, einem Bereich, der für die Kultivierung nicht leicht zugänglich ist. Laut Zetterberg et al. hat der zentrale Teil des Linsenepithels zwar unter normalen Umständen eine minimale mitotische Aktivität aufweist, Experimente mit tritiierter Thymidinmarkierung (3H-Tdr) diese zentral positionierten Linsenepithelzellen als potenzielle Stammzellen markiert17,22. Stammzellen weisen unterschiedliche Eigenschaften auf, wie z. B. eine unbegrenzte Proliferationskapazität, obwohl sie unter Standardbedingungen eine geringe Proliferationsrate aufweisen. Daher kann der zentrale Teil des Linsenepithels die Proliferationskapazität der LECs besser darstellen als die Keimzone.
Die Isolierung von LECs, wie in Protokollabschnitt 2 beschrieben, stellt einen entscheidenden Schritt in diesem experimentellen Verfahren dar. Integrale Maßnahmen wie das Entfernen der Linsenkapsel, der enzymatische Verdau und die Gewebefragmentierung werden sorgfältig durchgeführt, um einzelne Epithelzellen von der Kapsel zu trennen. Eines der kritischen Elemente innerhalb dieses Prozesses ist die Dauer des Trypsinverdaus. Es wird empfohlen, die Aufschlusszeit zwischen 8 und 10 Minuten einzustellen. Verkürzt sich dieser Zeitraum auf weniger als 5 Minuten, kann es zu einer unvollständigen Zelltrennung kommen. Umgekehrt kann eine Überdehnung dieses Zeitrahmens die Lebensfähigkeit der Zellen erheblich beeinträchtigen. Die strategische Entscheidung, Trypsin-EDTA als Zelldissoziationsreagenz in Verbindung mit einem DMEM-Kulturmedium zu verwenden, das mit 20 % FBS und 10 μg/ml Gentamicin ergänzt wird, optimiert die Zellfreisetzung und die anschließende Proliferation und mindert gleichzeitig potenzielle Kontaminationsrisiken.
Antibiotika werden häufig eingesetzt, um eine bakterielle Kontamination während primärer LEC-Kulturen zu verhindern. Die Auswahl der Antibiotika sollte jedoch sorgfältig getroffen werden. Häufig verwendete Antibiotika wie Penicillin und Streptomycin sowie Antimykotika haben das Potenzial, die Lebensfähigkeit von LECs zu beeinträchtigen. Als Alternative wird empfohlen, eine Gentamicinlösung in einer Konzentration von 10 μg/ml für ein optimales LEC-Wachstum zu verwenden.
Darüber hinaus ist die Aufrechterhaltung einer hohen Zelldichte ein weiterer entscheidender Faktor für eine erfolgreiche primäre LEC-Kultur. Im Gegensatz zu etablierten Zelllinien benötigen primäre LECs eine höhere Zelldichte für ein optimales Wachstum. Dies ist in erster Linie darauf zurückzuführen, dass sie auf eine effektive interzelluläre Kommunikation angewiesen sind, die durch direkten Kontakt oder parakrine Signale erleichtert wird und dazu beiträgt, ihren Differenzierungsstatus und ihre Funktion aufrechtzuerhalten. Eine hohe Zelldichte mildert auch die nachteiligen Auswirkungen eines "Kulturschocks", ein Zustand, den Primärzellen erleben, wenn sie isoliert und in eine In-vitro-Umgebung gebracht werden, die sich signifikant von ihrem In-vivo-Ursprung unterscheidet23. Durch die Nachahmung einer eher in vivo-ähnlichen Umgebung erhöht eine hohe Zelldichte die Überlebensraten. Darüber hinaus hilft diese Dichte, einen Konzentrationsgradienten von Wachstumsfaktoren und Zytokinen zu etablieren, der das Zellwachstum und die Zellfunktion unterstützt. Da viele Primärzellen verankerungsabhängig sind und für die Proliferation eine Oberflächenbindung erfordern, bietet eine hohe Zelldichte eine ausreichende Anzahl benachbarter Zellen für die Adhäsion und fördert so ein gesundes Wachstum. Folglich ist die Regulation der Zelldichte ein entscheidender Aspekt bei der Kultivierung von Primärzellen, da sie einen erheblichen Einfluss auf die Zellkommunikation, das Überleben und die Proliferation hat. Es wird empfohlen, sich für kleinere Kulturschalen wie 24-Well- oder 6-Well-Platten zu entscheiden, um eine ideale Umgebung für LECs zu schaffen. Das Befolgen dieses Protokolls führt in der Regel dazu, dass LECs ~10-14 Tage nach der Kultivierung einen konfluenten Zustand erreichen. Wir empfehlen, LECs bei einer geringen Anzahl von Durchgängen zu verwenden, idealerweise zwischen P0 und P6, um ein möglichst natürliches Verhalten in Experimenten zu gewährleisten. Jenseits von 7-10 Passagen können LECs ein vermindertes Wachstum aufweisen und möglicherweise nicht auf die gleiche Weise auf experimentelle Bedingungen reagieren wie Zellen in niedrigeren Passagen.
Die Serumkonzentration steht in direktem Zusammenhang mit der Geschwindigkeit des Zellwachstums. Niedrigere FBS-Spiegel induzieren eher ein langsameres Wachstum, ähnlich den Eigenschaften des zentralen Epithels. Im Gegensatz dazu ahmen höhere FBS-Spiegel die Bedingungen der proliferativen Zone nach. Wenn das Zellwachstum langsam ist, wie es auftreten kann, wenn LECs aus älteren oder genetisch veränderten Tieren isoliert werden müssen, kann es von Vorteil sein, FBS auf 20% zu erhöhen oder dem Kulturmedium ein Wachstumszusatz wie EpiCGS-a (5 ml, siehe Materialtabelle) hinzuzufügen. Diese Serum- und Nahrungsergänzungsmittelanreicherung kann die Zellproliferation verbessern und das optimale Wachstum von Epithelzellen fördern.
Das Lager- und Versandprotokoll (Protokollabschnitt 5) berücksichtigt die Herausforderungen, die mit der Konservierung und dem Transport lebender Zellen verbunden sind. Die Wahl des Gefriermediums ist entscheidend für das Überleben von LECs während der Lagerung und des Transports. Wir haben mit verschiedenen Gefriermedien experimentiert, darunter 70 % vollständiges Kulturmedium + 20 % FBS + 10 % DMSO; 90 % FBS + 10 % DMSO; und DMSO- und serumfreies Gefriermedium. Unsere Experimente deuten darauf hin, dass eine Lösung, die 10 % DMSO und 90 % FBS enthält, eine überlegene Leistung bei der Erhaltung der Zelllebensfähigkeit aufweist. Unter Verwendung dieser speziellen Formulierung haben wir primäre LECs erfolgreich bei -80 °C für eine Dauer von mehr als 10 Jahren gelagert, was die Robustheit dieses Ansatzes und seine Fähigkeit, die Wiederbelebung der Zellen nach der Lagerung zu erleichtern, unter Beweis stellt.
αA-Crystallin und γ-Crystallin wurden als Marker für LECs verwendet. PROX1 wurde als Marker für Linsenfaserzellen verwendet. Zusätzliche Marker wie PAX6, FOXE3 und E-Cadherin können ebenfalls verwendet werden, um den LEC-Phänotyp zu charakterisieren. Wenn Forscher an der Erforschung von EMT interessiert sind, sollte αSMA als Marker verwendet werden. Es ist wichtig, die Inkubationszeiten und Verdünnungen entsprechend den spezifischen Anforderungen des Experiments und den Empfehlungen für die jeweils verwendeten Antikörper anzupassen.
Obwohl diese Studie eine robuste Methodik für die Kultivierung primärer LECs darstellt, ist es wichtig, ihre Grenzen anzuerkennen. Während die zunächst isolierten Zellen primäre LECs sind, führen alle Subkultur-, Trypsinisierungs- und Reanimationsverfahren zu Veränderungen ihres Status. Das von uns entwickelte Protokoll verwendet hauptsächlich Mauslinsen als Quelle für LECs; LECs können jedoch auch aus anderen Ressourcen kultiviert werden, einschließlich Kataraktpatientenproben, Augenbankaugen oder Patienten mit verschiedenen Augenerkrankungen wie Glaukom und diabetischer Retinopathie17,24. LECs, die von älteren Personen oder solchen mit bestimmten Augenerkrankungen entnommen wurden, entsprechen dem Protokoll möglicherweise nicht so effektiv wie Zellen von jüngeren, gesünderen Kollegen. Die Kultivierung von LECs von älteren oder genetisch veränderten Individuen oder Tieren kann eine Optimierung des Nährmediums erfordern, möglicherweise durch Erhöhung des FBS auf 20 % oder durch die Einbeziehung zusätzlicher Wachstumsfaktoren. Darüber hinaus zeigten frühere Studien von Menko et al., die an primären embryonalen Hühnerlinsenepithelzellkulturen durchgeführt wurden, eine spontane Differenzierung, die nach dem zweiten Tag der Kulturstattfand 25. Daher sollten Forscher Vorsicht walten lassen und die Unterschiede in den Methoden berücksichtigen, insbesondere wenn die Untersuchung der Differenzierung ihr Hauptziel ist.
Es können verschiedene Methoden verwendet werden, um primäre LECs zu kultivieren. Zum Beispiel beinhalten die von Ibaraki et al., Sundelin et al. und Andjelic et al. entwickelten Methoden die Kultivierung primärer LECs direkt auf der Petrischale unter Verwendung des vorderen Teils der Linsenkapsel, der während der Kataraktoperation gesammelt wurde 16,17,19,20. Dieser Ansatz erhält die natürlichen Zell-zu-Zell-Kontakte und die extrazelluläre Matrix und bietet eine hohe physiologische Relevanz, die für Erkrankungen wie PCO entscheidend ist. Alternativ bewahrt die Linsenexplantatmethode, wie sie von Zelenka et al. beschrieben wurde, die native Gewebearchitektur und ermöglicht Studien, die physiologisch relevanter sind, insbesondere vorteilhaft für die Erforschung der terminalen Differenzierung von LECs, zellulären Interaktionen und Linsenentwicklungsprozessen, was ein detailliertes Verständnis der sequentiellen zellulären und molekularen Ereignisse während der Differenzierung ermöglicht26.
Im Gegensatz dazu erzeugt das in diesem Protokoll beschriebene Trypsinisierungsverfahren eine einheitliche Einzelzellsuspension, die eine gleichmäßige Aussaat und eine präzise Zellzählung vereinfacht, was für bestimmte Experimente wie Zellviabilitäts- und Proliferationsassays, Wirkstoffscreening und Zellsignalweganalyse von Vorteil ist. Es ist jedoch wichtig anzuerkennen, dass diese Methode zwar aufgrund ihrer einheitlichen Zellpopulation kontrollierte und präzise Studien ermöglicht, aber das zelluläre Verhalten verändern und die physiologische Relevanz der Explantat- und Direktkulturmethoden aufgrund der enzymatischen Verarbeitung beeinträchtigen kann. Für Forscher, die sich ausschließlich auf die Untersuchung von Epithelzellen konzentrieren, erweist sich diese Methode als äußerst anwendbar und bequem und bietet zuverlässige Einblicke in die Eigenschaften und das Verhalten dieser Zellen. Für diejenigen, deren wissenschaftliche Untersuchungen sich auf die zelluläre Differenzierung erstrecken, ist es jedoch unerlässlich, alternative Methoden wie Explantationstechniken in Betracht zu ziehen oder die aktuelle Methode anzupassen und zu optimieren, um diese Aspekte zu berücksichtigen.
Insgesamt wurde dieses Protokoll unter sorgfältiger Berücksichtigung der spezifischen Bedürfnisse und Anforderungen von LECs entwickelt. Jeder Schritt, von der Sektion bis zur Validierung, wird sorgfältig ausgearbeitet, um die Lebensfähigkeit und Funktionalität der Zellen zu erhalten. Daher kann es ein wertvoller Leitfaden für Forscher sein, die LECs und ihre Rolle in der Augenphysiologie und -pathologie untersuchen. Zukünftige Studien können dieses Protokoll anpassen und modifizieren, um verschiedene Aspekte der LEC-Biologie zu untersuchen und eine Plattform für weitere Fortschritte im Verständnis von linsenbedingten Krankheiten und die Entwicklung neuer therapeutischer Strategien zur Katarakt- und PCO-Prävention zu bieten.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde unterstützt von NEI R21EY033941 (an Hongli Wu); W81XWH2010896 des Verteidigungsministeriums (an Hongli Wu); R15GM123463-02 (für Kayla Green und Hongli Wu)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Thermo Fisher | #25300054 | For LECs dissociation |
| Alexa Fluor 488 Secondary Antibody | Jackson ImmunoResearch | #715-545-150 | For cell validation |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-605-003 | For cell validation |
| Antibody dilution buffer | Licor | #927-60001 | For cell validation |
| Beaver safety knife | Beaver-Visitec International | #3782235 | For lens dissection |
| Blocking buffer | Licor | #927-60001 | For cell validation |
| Capsulorhexis forceps | Titan Medical Instruments | TMF-124 | For lens capsule isolation |
| DMEM | Sigma Aldrich | D6429 | For LECs culture medium |
| DMSO | Sigma Aldrich | #D2650 | For making freezing medium |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Thermo Fisher | #J67802 | For lens dissection |
| Dumont tweezers | Roboz Surgical Instrument | RS-4976 | For lens capsule isolation |
| EpiCGS-a (optional) | ScienCell | 4182 | For LECs culture medium |
| FBS | Sigma Aldrich | F2442 | For LECs culture medium |
| Gentamicin (50 mg/mL) | Sigma-Aldrich | G1397 | For LECs culture medium |
| Hoechst 33342 solution | Thermo Fisher | #62249 | For cell validation |
| Micro-dissecting scissors | Roboz Surgical Instrument | RS-5983 | For lens dissection |
| Micro-dissecting tweezers | Roboz Surgical Instrument | RS5137 | For lens dissection |
| PROX1 antibody | Thermo Fisher | 11067-2-AP | For cell validation |
| Vannas micro-dissecting spring scissors | Roboz Surgical Instrument | RS-5608 | For lens capsule isolation |
| αA-crystallin antibody | Santa Cruz | sc-28306 | For cell validation |
| γ-crystallin antibody | Santa Cruz | sc-365256 | For cell validation |
References
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