Questo manoscritto delinea un protocollo video dettagliato per la coltura di cellule epiteliali primarie del cristallino (LEC), con l'obiettivo di migliorare la riproducibilità e aiutare la ricerca sulla cataratta e sull'opacizzazione della capsula posteriore (PCO). Offre istruzioni dettagliate sulla dissezione delle lenti, l'isolamento e la convalida dei LEC, fungendo da guida preziosa, soprattutto per i nuovi arrivati nel settore.
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Articolo metodologico
Ottimizzazione della coltura di cellule epiteliali primarie del cristallino di topo: una guida completa alla tripsinizzazione
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le cellule epiteliali del cristallino (LEC) svolgono molteplici ruoli importanti nel mantenimento dell'omeostasi e della normale funzione del cristallino. I LEC determinano la crescita, lo sviluppo, le dimensioni e la trasparenza delle lenti. Al contrario, i LEC disfunzionali possono portare alla formazione della cataratta e all'opacizzazione della capsula posteriore (PCO). Di conseguenza, la creazione di un solido sistema di coltura LEC primario è importante per i ricercatori impegnati nello sviluppo di lenti, nella biochimica, nelle terapie della cataratta e nella prevenzione della PCO. Tuttavia, la coltivazione di LEC primari ha presentato a lungo sfide a causa della loro disponibilità limitata, del lento tasso di proliferazione e della natura delicata.
Questo studio affronta questi ostacoli presentando un protocollo completo per la coltura LEC primaria. Il protocollo comprende fasi essenziali come la formulazione di un terreno di coltura ottimizzato, l'isolamento preciso delle capsule di lenti, le tecniche di tripsinizzazione, le procedure di sottocoltura, i protocolli di raccolta e le linee guida per lo stoccaggio e la spedizione. Durante tutto il processo di coltura, la morfologia cellulare è stata monitorata utilizzando la microscopia a contrasto di fase.
Per confermare l'autenticità dei LEC in coltura, sono stati condotti saggi di immunofluorescenza per rilevare la presenza e la distribuzione subcellulare di proteine lente critiche, vale a dire αA- e γ-cristalline. Questo protocollo dettagliato fornisce ai ricercatori una risorsa preziosa per coltivare e caratterizzare i LEC primari, consentendo progressi nella nostra comprensione della biologia del cristallino e nello sviluppo di strategie terapeutiche per i disturbi correlati al cristallino.
Introduzione
Il cristallino dell'occhio svolge un ruolo cruciale nella visione focalizzando la luce in entrata sulla retina. È costituito da una struttura trasparente e avascolare composta da cellule specializzate, tra le quali le cellule epiteliali del cristallino (LEC) sono protagoniste. I LEC si trovano sulla superficie anteriore del cristallino e sono responsabili del mantenimento della sua trasparenza, della regolazione dell'equilibrio idrico e della partecipazione alla crescita e allo sviluppo del cristallino 1,2. I LEC sono un tipo unico di cellule situate nella parte anteriore del cristallino, che svolgono un ruolo....
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Protocollo
Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con le linee guida dell'Associazione per la ricerca sulla visione e l'oftalmologia per l'uso degli animali nella ricerca oftalmica e sulla visione. L'approvazione procedurale è stata concessa dal Comitato per la cura e l'uso degli animali dell'Università del Texas settentrionale Health Science Center (numero di protocollo: IACUC-2022-0008). In questi studi sono stati utilizzati topi giovani C57BL/6J, in genere di età inferiore alle 2 settimane.
1. Preparazione del terreno di coltura e dissezione delle lenti
- Preparare il terreno di coltura aggiun....
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Risultati
Come mostrato nella Figura 2, seguendo questo protocollo, i LEC primari dei topi C57BL/6J hanno aderito alle piastre entro un periodo di 4 ore. In particolare, c'erano resti visibili di altri tessuti come sezioni della capsula posteriore e cellule della fibra del cristallino. Tuttavia, questi elementi non intenzionali non si attaccavano al piatto e potevano, quindi, essere rimossi cambiando il terreno di coltura. Successivamente, tra il terzo e il quinto giorno, i LEC hanno iniziato la loro .......
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Discussione
Il protocollo presentato in questo documento fornisce una guida completa e dettagliata per il successo dell'isolamento, della cultura e della sottocultura dei LEC primari, completa di documentazione video di accompagnamento. La guida visiva dettagliata, insieme alle istruzioni scritte, migliora la chiarezza e l'accessibilità del protocollo, promuovendone l'uso e la riproducibilità tra i ricercatori del settore. L'obiettivo finale è quello di contribuire all'espansione delle conoscenze che circondano il ruolo dei LEC nell.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto da NEI R21EY033941 (a Hongli Wu); Dipartimento della Difesa W81XWH2010896 (a Hongli Wu); R15GM123463-02 (a Kayla Green e Hongli Wu)
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 0,05% Tripsina-EDTA | Thermo Fisher | 25300054 | Per la dissociazione LEC |
| Alexa Fluor 488 Anticorpo secondario | Jackson ImmunoResearch | #715-545-150 | Per la convalida cellulare |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-605-003 | Per la convalida cellulare |
| Tampone di diluizione degli anticorpi | Licor | #927-60001 | Per la convalida cellulare |
| Coltello di sicurezza Beaver-Visitec | International | #3782235 | Per la dissezione |
| delle lentiTampone di blocco | Licor | #927-60001 | Per la convalida cellulare |
| Pinze per capsuloressi | Titan Medical Instruments | TMF-124 | Per l'isolamento della capsula della lente |
| DMEM | Sigma Aldrich | D6429 | Per il terreno di coltura LEC |
| DMSO | Sigma Aldrich | #D2650 | Per la produzione di terreno di congelamento |
| salina tamponata con fosfato di Dulbecco | Thermo Fisher | #J67802 | Per la dissezione delle lenti, |
| Pinzette Dumont | Roboz Strumento chirurgico | RS-4976 | Per l'isolamento della capsula delle lenti, |
| EpiCGS-a (opzionale) | ScienCell | 4182 | Per i terreni di coltura delle LEC, |
| FBS, | Sigma, Aldrich, | F2442 | Per i terreni di coltura delle LEC: |
| Gentamicina (50 mg/mL) | Sigma-Aldrich | G1397 | Per terreno di coltura LEC |
| Soluzione Hoechst 33342 | Thermo Fisher | #62249 | Per la convalida cellulare |
| Forbici per micro-dissezione | Roboz Surgical Instrument | RS-5983 | Per la dissezione delle lenti |
| Pinzette per micro-dissezione | Strumento chirurgico Roboz | RS5137 | Per la dissezione delle lenti |
| Anticorpo PROX1 | Thermo Fisher | 11067-2-AP | Per la convalida cellulare |
| Forbici a molla per micro-dissezione Vannas | Strumento chirurgico Roboz | RS-5608 | Per l'isolamento della capsula del lente |
| α Anticorpo A-crystallina | Santa Cruz | sc-28306 | Per la convalida cellulare |
| Anticorpo γ-cristallina | Santa Cruz | sc-365256 | Per la validazione cellulare |
Riferimenti
- Bermbach, G., Mayer, U., Naumann, G. O. Human lens epithelial cells in tissue culture. Experimental Eye Research. 52 (2), 113-119 (1991).
- Reddy, V. N., Lin, L. R., Arita, T., Zigler, J. S. Jr, Huang, Q. L. Crystallins and their synthesis in human lens epithelial cel....
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Ristampe e permessi
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