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Articolo metodologico
Descriviamo un protocollo per stabilire un modello di coltura di interfaccia aria-liquido (ALI) utilizzando cellule epiteliali delle vie aeree tracheali neonatali (nTAEC) ed eseguire l'esposizione all'iperossia fisiologicamente rilevante per studiare l'effetto dello stress ossidativo indotto dall'atmosfera sulle cellule derivate dall'epitelio della superficie delle vie aeree neonatali in via di sviluppo.
L'epitelio neonatale pretermine è costantemente esposto a fattori di stress ambientale. Uno di questi fattori di stress nei neonati con malattie polmonari include la tensione dell'ossigeno (O2) superiore a quella dell'atmosfera ambientale, definita iperossia (>21% O2). L'effetto dell'iperossia sulle vie aeree dipende da vari fattori, tra cui lo stadio di sviluppo delle vie aeree, il grado di iperossia e la durata dell'esposizione, con esposizioni variabili che possono portare a fenotipi unici. Sebbene siano state condotte ricerche approfondite sull'effetto dell'iperossia sull'alveolarizzazione polmonare neonatale e sull'iperreattività delle vie aeree, poco si sa sull'effetto sottostante a breve e lungo termine dell'iperossia sulle cellule epiteliali delle vie aeree neonatali umane. Una delle ragioni principali di ciò è la scarsità di un modello in vitro efficace per studiare lo sviluppo e la funzione epiteliale delle vie aeree neonatali umane. Qui, descriviamo un metodo per isolare ed espandere le cellule epiteliali delle vie aeree tracheali neonatali umane (nTAEC) utilizzando aspirati tracheali neonatali umani e coltivando queste cellule in coltura di interfaccia aria-liquido (ALI). Dimostriamo che gli nTAEC formano un monostrato di cellule polarizzate mature in coltura di ALI e vanno incontro a differenziamento mucociliare. Presentiamo anche un metodo per l'esposizione moderata all'iperossia del monostrato cellulare in coltura di ALI utilizzando un incubatore specializzato. Inoltre, descriviamo un test per misurare lo stress ossidativo cellulare a seguito di esposizione all'iperossia in coltura di ALI utilizzando la quantificazione fluorescente, che conferma che l'esposizione moderata all'iperossia induce stress ossidativo cellulare ma non causa danni significativi alla membrana cellulare o apoptosi. Questo modello può potenzialmente essere utilizzato per simulare l'esposizione all'iperossia clinicamente rilevante riscontrata dalle vie aeree neonatali nell'Unità di Terapia Intensiva Neonatale (NICU) e utilizzato per studiare gli effetti a breve e lungo termine dell'O2 sulla programmazione epiteliale delle vie aeree neonatali. Gli studi che utilizzano questo modello potrebbero essere utilizzati per esplorare modi per mitigare il danno ossidativo precoce alle vie aeree in via di sviluppo, che è implicato nello sviluppo di malattie delle vie aeree a lungo termine negli ex neonati prematuri.
L'ossigeno terapeutico (O2) è una delle terapie più utilizzate nell'unità di terapia intensiva neonatale (NICU)1. Di conseguenza, l'esposizione all'iperossia (>21% O2) è un fattore di stress atmosferico comune riscontrato dai neonati con e senza malattia polmonare significativa. Le risposte polmonari all'iperossia possono variare a seconda dell'intensità e/o della durata dell'esposizione e della posizione anatomica, del tipo di cellula e dello stadio di sviluppo polmonare 2,3,4,5,6.
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I campioni di aspirato tracheale neonatale sono stati raccolti solo dopo il consenso informato dei genitori e il protocollo utilizzato per la raccolta, il trasporto e la conservazione è stato approvato dall'Institutional Review Board (IRB) dell'Health Sciences Center dell'Università dell'Oklahoma (IRB 14377).
1. Preparazione all'isolamento, al passaggio e alla coltura ALI di nTAEC
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Per isolare gli nTAEC, abbiamo raccolto aspirati tracheali da neonati intubati nella terapia intensiva neonatale e trasportato gli aspirati su ghiaccio in laboratorio per un'ulteriore elaborazione (Figura 1A). Dopo aver seminato i campioni di aspirato tracheale in un terreno di crescita epiteliale delle vie aeree (BLEAM-I contenente inibitori di Rho/Smad, GSK3 e mTOR), le cellule cuboidali sono comparse entro 7-10 giorni. Entro 14 giorni, le cellule erano co.......
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Il protocollo qui descritto descrive in dettaglio un metodo per la raccolta e l'elaborazione di campioni di aspirato tracheale neonatale da neonati intubati in terapia intensiva neonatale con successivo isolamento ed espansione di nTAEC vivi da questi campioni utilizzando metodi precedentemente stabiliti39. Inoltre, abbiamo descritto un metodo per la coltura di nTAEC su ALI e la caratterizzazione della loro differenziazione in un epitelio mucociliare polarizzato d.......
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Gli autori non hanno nulla da rivelare e nessun conflitto di interessi da segnalare.
Questo lavoro è supportato da finanziamenti della Presbyterian Health Foundation (PHF) e dell'Oklahoma Shared Clinical and Translational Resources (U54GM104938 con un Institutional Development Award (IDeA) da NIGMS) ad AG. Vorremmo ringraziare il Dr. Paul LeRou e il Dr. Xingbin Ai del Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, Boston, Massachusetts, per aver fornito cellule di donatori neonatali utilizzate in alcuni degli esperimenti. Le figure sono state create con Biorender. L'analisi statistica è stata eseguita con GraphPad Prism.
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| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Formalina tamponata al 10% | Fisher Scientific | 23-426796 | |
| 1X PBS (soluzione salina tamponata con fosfato), pH 7,4 | Gibco | 10010049 | |
| A 83-01 | Tocris | 29-391-0 | |
| Inserti ALI Transwell, 6,5 mm | Corning | 3470 | |
| Anticorpo anti-tubulina acetilata, monoclonale di topo | Sigma | T7451 | |
| Anticorpo anti-alfa tubulina | Abcam | ab7291 | |
| Anticorpo anti-citocheratina 5 | Abcam | ab53121 | |
| BronchiaLife Epithelial Airway Medium (BLEAM) | LifeLine Cell Technology | LL-0023 | |
| CHIR 99021 | Tocris | 44-231-0 | |
| Anticorpo caspasi-3 scissa | Segnalazione cellulare | 9664T | |
| SCGB1A1 o proteina delle cellule club (CC16) umano, anticorpo policlonale di coniglio | BioVendor R& D | RD181022220-01 | |
| CM-H2DCFDA (indicatore generale di stress ossidativo) | Thermo Scientific | C6827 | |
| Corning Colture cellulari Flaconi T25 trattati | Corning | 430639 | |
| Corning Colture cellulari a forma di U Corning Flaconi T75 | Corning | 430641U | |
| CyQUANT LDH Saggio di citotossicità | Thermo Scientific | C20300 | |
| DAPI Soluzione (1 mg/mL) | Fisher Scientific | EN62248 | |
| Dimetilsolfossido [DMSO] Hybri-Max | Sigma | D2650 | |
| Acqua distillata | Gibco | 15230162 | |
| EVOM Manuale per la misurazione TEER | Precision Instrument | EVM-MT-03-01 | |
| FBS (Siero fetale bovino) | Gibco | 10082147 | |
| Isotiocianato di fluoresceina destrano (media mol wt 10.000) | Fisher Scientific | F0918100MG | |
| Isotiocianato di fluoresceina... destrano (peso medio mol 20,00) | Sigma | FD20-100MG | |
| IgG anti-topo di capra (H+L), annunci umani-HRP | Southern Biotech | 1031-05 | |
| Anticorpo secondario adsorbito incrociato anti-topo di capra, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-21141 | |
| Anticorpo secondario altamente adsorbito anti-coniglio di capra (H+L), Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A-11035 | |
| IgG anti-coniglio di capra (H+L), topolino/umano ads-HRP | Southern Biotech | 4050-05 | |
| HBTEC Interfaccia aria-liquido (ALI) Differenziazione Media | LifeLine Cell Technology | LM-0050 | |
| HEPES | Lonza | CC-5024 | |
| Heracell VIOS 160i Tri-Gas CO2 Incubatore, 165 L | Thermo Scientific | 51030411 | |
| Kit di trascrizione inversa del cDNA ad alta capacità | Thermo Scientific | 4368814 | |
| Integratore HLL | LifeLine Cell Technology | LS-1001 | |
| ImageJ | NIH | N/A | |
| Invivogen Normocin - Reagente antimicrobico | Fisher Scientific | ||
| L-Glutammina | LifeLine Cell Technology | LS-1013 | |
| Siero di capra normale | Gibco | ||
| Normocin | Invivogen | ant-nr-05 | |
| p63 anticorpo | Santa Cruz Biotechnology | sc-25268 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Invitrogen | P36930 | |
| PureLink RNA Mini Kit | Thermo Scientific | 12183025 | |
| RAPAMYCIN | Thermo Scientific | AAJ62473MC | |
| TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Scientific | 4444964 | |
| Saggi di espulsione genica Taqman: 18S rRNA | Thermo Scientific | Hs99999901_s1 | |
| Saggi di espulsione genica Taqman: CAT | Thermo Scientific | Hs00156308_m1 | |
| Saggi di espulsione genica Taqman: FOXJ1 | Thermo Scientific | Hs00230964_m1 | |
| Saggi di espulsione genica Taqman: GAPDH | Thermo Scientific | Hs02786624_g1 | |
| Saggi di espulsione genica Taqman: GPX1 | Thermo Scientific | Hs00829989_gH | |
| Saggi di espulsione genica Taqman: GPX2 | Thermo Scientific | Hs01591589_m1 | |
| Saggi di escressione genica Taqman: GPX3 | Thermo Scientific | Hs01078668_m1 | |
| Saggi di escressione genica Taqman: KRT5 | Thermo Scientific | ||
| Saggi di escressione genica Taqman: MUC5AC | Saggi | ||
| Saggi di espulsione genica Taqman | |||
| Thermo Scientific Unità filtranti monouso sterili a flusso rapido Nalgene con membrana in PES (0,22 μ m pori, 500 ml) | Thermo Scientific | 5660020 | |
| TM-1 Integratore combinato | LifeLine Cell Technology | LS-1055 | |
| Anticorpo caspasi-3 | totale Segnalazione cellulare | 14220S | |
| Triton X-100 | Sigma | 9036-19-5 | |
| Tripsina-EDTA (0,05%), Fenolo rosso | Gibco | 25300062 | |
| Y-27632 2 HCl | Tocris | Codice 12-541-0 |
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