Blod-hjerne-barrieren (BBB) spiller en afgørende rolle for at opretholde et stabilt og sundt hjernemiljø. BBB dysfunktion er forbundet med mange neurologiske sygdomme. Vi har udviklet en 3D, stamcelleafledt model af BBB for at undersøge cerebrovaskulær patologi, BBB-integritet, og hvordan BBB ændres af genetik og sygdom.
Blod-hjerne-barrieren (BBB) er en vigtig fysiologisk komponent i centralnervesystemet (CNS), opretholder næringsstoffer, rydder affald og beskytter hjernen mod patogener. BBB’s iboende barriereegenskaber udgør en udfordring for terapeutisk lægemiddellevering til CNS til behandling af neurologiske sygdomme. Nedsat BBB-funktion har været relateret til neurologisk sygdom. Cerebral amyloid angiopati (CAA), aflejring af amyloid i cerebral vaskulatur, der fører til en kompromitteret BBB, er en co-morbiditet i de fleste tilfælde af Alzheimers sygdom (AD), hvilket tyder på, at BBB dysfunktion eller nedbrydning kan være involveret i neurodegeneration. På grund af begrænset adgang til humant BBB-væv forbliver de mekanismer, der bidrager til korrekt BBB-funktion og BBB-degeneration, ukendte. For at løse disse begrænsninger har vi udviklet en human pluripotent stamcelleafledt BBB (iBBB) ved at inkorporere endotelceller, pericytter og astrocytter i en 3D-matrix. iBBB samler sig selv for at rekapitulere anatomien og cellulære interaktioner, der findes i BBB. Såning af iBBB’er med amyloid fanger nøgleaspekter af CAA. Derudover tilbyder iBBB en fleksibel platform til at modulere genetiske og miljømæssige faktorer, der er involveret i cerebrovaskulær sygdom og neurodegeneration, for at undersøge, hvordan genetik og livsstil påvirker sygdomsrisikoen. Endelig kan iBBB bruges til lægemiddelscreening og medicinalkemiske undersøgelser for at optimere terapeutisk levering til CNS. I denne protokol beskriver vi differentieringen af de tre typer celler (endotelceller, pericytter og astrocytter), der stammer fra humane pluripotente stamceller, hvordan man samler de differentierede celler i iBBB, og hvordan man modellerer CAA in vitro ved hjælp af eksogent amyloid. Denne model overvinder udfordringen med at studere levende menneskeligt hjernevæv med et system, der har både biologisk troskab og eksperimentel fleksibilitet, og muliggør forhør af den menneskelige BBB og dens rolle i neurodegeneration.
Blod-hjerne-barrieren (BBB) er et vigtigt mikrovaskulært netværk, der adskiller centralnervesystemet (CNS) fra periferien for at opretholde et ideelt miljø for korrekt neuronal funktion. Det har en kritisk rolle i reguleringen af tilstrømning og udstrømning af stoffer til CNS ved at opretholde metabolisk homeostase 1,2,3,4, rydde affald 4,5,6 og beskytte hjernen mod patogener og toksiner 7,8.
Den primære celletype af BBB er endotelcellen (EC). Endotelceller, der stammer fra mesoderm-slægten, danner væggene i vaskulaturen 1,9. Mikrovaskulære EC’er danner tætte kryds med hinanden for i høj grad at reducere permeabiliteten af deres membran 10,11,12,13,14, mens de udtrykker transportører for at lette bevægelsen af næringsstoffer ind og ud af CNS 1,4,12,14 . Mikrovaskulære EC’er er omgivet af pericytter (PC’er)-vægmalerier, der regulerer mikrovaskulær funktion og homeostase og er kritiske for regulering af BBB’s permeabilitet for molekyler og immunceller 15,16,17. Astrocytten, en vigtig gliacelletype, er den endelige celletype, der omfatter BBB. Astrocyte endefødder vikles rundt om EC-PC-vaskulærrørene, mens cellelegemerne strækker sig ind i hjernens parenchyma og danner en forbindelse mellem neuroner og vaskulatur1. Forskellige opløste stoffer og substrattransportører er lokaliseret på astrocytendefødder (f.eks. aquaporin 4 [AQP-4]), der har en kritisk rolle i BBB-funktion 18,19,20,21.
BBB er afgørende for at opretholde korrekt hjernesundhedsfunktion, og dysfunktion af BBB er blevet rapporteret i mange neurologiske sygdomme, herunder Alzheimers sygdom (AD) 22,23,24,25, multipel sklerose 7,26,27,28, epilepsi 29,30 og slagtilfælde31,32. Det anerkendes i stigende grad, at cerebrovaskulære abnormiteter spiller en central rolle i neurodegeneration, hvilket bidrager til øget modtagelighed for iskæmiske og hæmoragiske hændelser. For eksempel har mere end 90% af AD-patienter cerebral amyloid angiopati (CAA), en tilstand karakteriseret ved aflejring af amyloid β (Aβ) langs cerebral vaskulatur. CAA øger BBB-permeabiliteten og nedsætter BBB-funktionen, hvilket efterlader CNS sårbar over for iskæmi, hæmoragiske hændelser og accelereret kognitiv tilbagegang33.
Vi har for nylig udviklet en in vitro-model af den humane BBB, afledt af patientinducerede pluripotente stamceller, som inkorporerer EC’er, PC’er og astrocytter indkapslet i en 3D-matrix (figur 1A). iBBB rekapitulerer fysiologisk relevante interaktioner, herunder vaskulær rørdannelse og lokalisering af astrocytendefødder med vaskulatur24. Vi anvendte iBBB til at modellere følsomheden af CAA medieret af APOE4 (figur 1B). Dette gjorde det muligt for os at identificere de kausale cellulære og molekylære mekanismer, hvormed APOE4 fremmer CAA, og udnytte disse indsigter til at udvikle terapeutiske strategier, der reducerer CAA-patologi og forbedrer læring og hukommelse in vivo hos APOE4-mus24. Her giver vi en detaljeret protokol og videovejledning til rekonstruktion af BBB fra humane iPSC’er og modellering af CAA in vitro.
BBB dysfunktion er en co-morbiditet, og potentielt en årsag eller forværrende faktor i talrige neurologiske sygdomme 7,40,41. Det er imidlertid næsten umuligt at studere molekylær- og cellebiologien, der ligger til grund for dysfunktion og nedbrydning af BBB hos mennesker med neurovaskulær sygdom. Den inducerbare-BBB (iBBB), der præsenteres i denne protokol, tilvejebringer et in vitro-system, der rekapitulerer vig…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde er støttet af NIH 3-UG3-NS115064-01, R01NS14239, Cure Alzheimers Fund, NASA 80ARCO22CA004, Chan-Zuckerberg Initiative, MJFF / ASAP Foundation og Brain Injury Association of America. C.G. er støttet af NIH F31NS130909. Figur 1A blev oprettet med BioRender.com.
6e10 amyloid-β antibody | Biolegend | SIG-39320 | Used at 1:1000 |
Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
Activin A | Peprotech | 20-14E | |
Alexa Fluor 488, 555, 647 secondary antibodies | Invitrogen | Various | Used at 1:1000 |
Amyloid-beta 40 fibril | AnaSpec | AS-24235 | |
Amyloid-beta 42 fibril | AnaSpec | AS-20276 | |
Aquaporin-4 antibody | Invitrogen | PA5-53234 | Used at 1:300 |
Astrocyte basal media and supplements | ScienCell | 1801 | |
B-27 serum-free supplement | Gibco | 17504044 | |
BMP4 | Peprotech | 120-05ET | |
CHIR99021 | Cyamn Chemical | 13112 | |
DMEM/F12 with GlutaMAX medium | Gibco | 10565018 | |
Doxycycline | Millipore-Sigma | D3072-1ML | |
FGF-basic | Peprotech | 100-18B | |
Fluoromount-G slide mounting medium | VWR | 100502-406 | |
Forskolin | R&D Systems | 1099/10 | |
GeltrexTM LDEV-Free hESC-qualified Reduced Growth Factor Basement | Gibco | A1413302 | |
Glass Bottom 48-well Culture Dishes | Mattek Corporation | P48G-1.5-6-F | |
GlutaMAX supplement | Gibco | 35050061 | |
Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | |
Human Endothelial Serum-free medium | Gibco | 11111044 | |
LDN193189 | Tocris | 6053 | |
Minimum Essential Medium Non-essential Amino Acid Solution (MEM-NEAA) | Gibco | 11140050 | |
N-2 supplement | Gibco | 17502048 | |
Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | |
Normal Donkey Serum | Millipore-Sigma | S30-100mL | Use serum to match secondary antibody host |
Paraformaldehyde (PFA) | ThermoFisher | 28908 | |
PDGF-BB | Peprotech | 100-14B | |
PDGFRB (Platelet-derived growth factor receptor beta) antibody | R&D Systems | AF385 | Used at 1:500 |
Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4 | Gibco | 10010031 | |
Pecam1 (Platelet endothelial cell adhesion molecule 1) antibody | R&D Systems | AF806 | Used at 1:500 |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
PiggyBac plasmid (PB_iETV2_P2A_GFP_Puro) | AddGene | Catalog #168805 | |
S100B antibody | Sigma-Aldrich | S2532-100uL | Used at 1:500 |
SB43152 | Reprocell | 04-0010 | |
Thioflavin T | Chem Impex | 22870 | Used at 25uM |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-250mL | |
VE-cadherin (CD144) antibody | R&D systems | AF938 | Used at 1:500 |
VEGF-A | Peprotech | 100-20 | |
Y27632 | R&D Systems | 1254/10 | |
ZO-1 | Invitrogen | MA3-39100-A488 | Dilution = 1:500 |