Qui, presentiamo un metodo per identificare i composti che modulano il meccanismo ADCC, un importante meccanismo di uccisione delle cellule tumorali degli anticorpi antitumorali. L'effetto citotossico delle cellule NK è misurato negli sferoidi delle cellule del cancro al seno in presenza di Trastuzumab. L'analisi delle immagini identifica le cellule killer vive e morte e le cellule bersaglio negli sferoidi.
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Articolo metodologico
Quantificazione della citotossicità cellulare anticorpo-dipendente in un modello di sferoide tumorale: applicazione per la scoperta di farmaci
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'immunoterapia basata su anticorpi monoclonali che ha come bersaglio gli antigeni tumorali è ora un pilastro del trattamento del cancro. Uno dei meccanismi d'azione clinicamente rilevanti degli anticorpi è la citotossicità cellulare anticorpo-dipendente (ADCC), in cui l'anticorpo si lega alle cellule tumorali e impegna la componente cellulare del sistema immunitario, ad esempio le cellule natural killer (NK), per uccidere le cellule tumorali. L'efficacia di queste terapie potrebbe essere migliorata identificando composti adiuvanti che aumentano la sensibilità delle cellule tumorali o la potenza delle cellule immunitarie. Inoltre, interazioni farmacologiche non scoperte in pazienti oncologici co-medicati per condizioni pregresse o sintomi associati al cancro possono determinare il successo della terapia anticorpale; Pertanto, tali interazioni farmacologiche indesiderate devono essere eliminate. Con questi obiettivi in mente, abbiamo creato un modello di ADCC per il cancro e descriviamo qui un semplice protocollo per trovare farmaci modulanti l'ADCC. Poiché i modelli 3D come gli sferoidi delle cellule tumorali sono superiori alle colture 2D nel predire le risposte in vivo dei tumori alle terapie antitumorali, le co-colture sferoidi di cellule di carcinoma mammario HER2+ JIMT-1 che esprimono EGFP e NK92. Le linee cellulari CD16 sono state create e indotte con Trastuzumab, un anticorpo monoclonale clinicamente approvato contro il carcinoma mammario HER2-positivo. Gli sferoidi JIMT-1 sono stati lasciati formare in piastre a 96 pozzetti con fondo a U repellenti per le cellule. Il giorno 3 sono state aggiunte cellule NK e Trastuzumab. Gli sferoidi sono stati poi colorati con Annexin V-Alexa 647 per misurare la morte cellulare apoptotica, che è stata quantificata nella zona periferica degli sferoidi con un microscopio automatizzato. L'applicabilità del nostro test per identificare le molecole modulanti l'ADCC è dimostrata dimostrando che Sunitinib, un inibitore della tirosin-chinasi approvato dalla FDA contro il cancro metastatico, abolisce quasi completamente l'ADCC. La generazione degli sferoidi e le pipeline di acquisizione e analisi delle immagini sono compatibili con lo screening ad alto rendimento per i composti modulanti ADCC negli sferoidi delle cellule tumorali.
Introduzione
Gli sferoidi tumorali multicellulari (MCTS) sono modelli tridimensionali (3D) ampiamente utilizzati che si formano a causa della tendenza delle cellule aderenti ad aggregarsi e rappresentano uno strumento importante per ottenere informazioni meccanicistiche sulla biologia delle cellule tumorali. Possono essere generati da un'ampia gamma di tipi di cellule mediante numerose tecniche, come le colture 3D a base liquida e basata su scaffold1. Il loro principale vantaggio rispetto ai modelli 2D monostrato è che ricapitolano le caratteristiche principali dei tumori in vivo , vale a dire l'organizzazione strutturale e l'ipossia, imitando il c....
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Protocollo
1. Impostazione del modello sferoidale della proteina fluorescente potenziata JIMT-1 (EGFP)
- Per formare un fondo repellente per cellule a forma di U, rivestire la piastra a 96 pozzetti con una soluzione di agarosio-PBS allo 0,5% (30 μL/pozzetto). Incubare la piastra a temperatura ambiente per circa 30-45 min.
- Lavare due volte le cellule JIMT-1-EGFP con 2 mL di PBS sterile (la generazione della linea cellulare JIMT1-EGFP è stata riportata in una precedente pubblicazione17). Utilizzare palloni per coltura tissutale T25 e terreni JIMT-1 (terreno DMEM/F-12 integrato con il 20% di siero fetale bovino (FBS), 0,3 U....
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Risultati
Sono state generate cellule JIMT-1 che esprimono EGFP e da queste cellule sono stati coltivati sferoidi. Sunitinib è stato utilizzato come composto di prova in quanto è stato precedentemente dimostrato che influisce sul decorso dell'ADCC17. Gli sferoidi sono stati lasciati aggregare per 72 ore. Il giorno 3, 10 μg/mL di Trastuzumab (o 6,6 μg/mL TR-F(ab')219) equimolari e cellule NK (20:1) sono stati aggiunti agli sferoidi in presenza o in assenza di 20 μM di Sunit.......
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Discussione
Nonostante i significativi miglioramenti nel trattamento della BC negli ultimi decenni, i pazienti sviluppano ancora regolarmente resistenza ai farmaci o sperimentano effetti collaterali negativi24. L'elevata morbilità e mortalità legate alla BC richiede una continua indagine sui meccanismi molecolari sottostanti, così come robuste piattaforme di screening per identificare nuove molecole utilizzabili per lo sviluppo terapeutico25. Queste strategie richiedono saggi traduzion.......
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Dichiarazioni
Gli autori hanno dichiarato di non avere conflitti di interesse.
Ringraziamenti
LV ha ricevuto finanziamenti dall'Ufficio nazionale per la ricerca, lo sviluppo e l'innovazione sovvenzioni GINOP-2.3.2-15-2016-00010 TUMORDNS", GINOP-2.3.2-15-2016-00048-STAYALIVE, OTKA K132193 e K147482. Questo progetto ha ricevuto finanziamenti dalla rete di ricerca ungherese HUN-REN. Le cellule CD16.176V.NK-92 sono state ottenute dal Dr. Kerry S. Campbell (Fox Chase Center, Philadelphia, PA, per conto di Brink Biologics, lnc. San Diego, CA), sono protetti da brevetti in tutto il mondo e sono stati concessi in licenza da Nantkwest, lnc. (www.nantkwest.com). Gli autori sono grati a György Vereb e Árpád Szöőr per il loro aiuto con l'uso della linea cellulare NK-92 e ....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Cell Carrier Ultra micropiastre | PerkinElmer, Waltham, MA, USA | LLC | per la misurazione degli sferoidi |
| Piastre per coltura tissutale a 96 pozzetti | TPP | 92096 | per la semina cellulare |
| α-MEM terreno | Sigma | M8042 | in NK |
| terreno Agarosio | Sigma | A9539 | per la semina di sferoidi |
| Annexin V-Alexa Fluo 647 coniugato | Invitrogen-ThermoFisher Scientific | A23204 | per la misurazione dell'apoptosi con cellule HCS |
| CD16.176 V.NK-92 | Dr. Kerry S. Campbell (Fox Chase Cancer Center, Philadelphia, PA per conto di Brink Biologics, Inc. San Diego, CA) | ATCC CRL-2407 | per colture cellulari |
| Cell Tracker Blue | Invitrogen-Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) | C2110 | per la colorazione di cellule NK |
| DMEM/ F-12 medium | Sigma | D8437 | in JIMT1-EGFP medium |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418 | per il rivestimento della piastra HCS prima del trasferimento degli sferoidi |
| Siero fetale bovino (FBS) | Biosiero | FB-1090/500 | JIMT-1-EGFP e NK medium |
| Glutammina | Gibco | 35.050" 061 | in NK medio |
| GraphPad Prism 8.0.1 | GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA | per l'analisi statistica | |
| Software Harmony | PerkinElmer, Waltham, MA, USA | per HCA | |
| IL-2 | Proleuchina, Novartis Hungá ria Kft., Budapest, Ungheria | PHC0026 | in NK medium |
| Insulina (Humulin R) | Eli Lilly | HI0219 | JIMT-1-EGFP medium |
| JIMT-1 cellule di cancro | per colture cellulari | ||
| MEM Aminoacidi non essenziali (MEM-NEAA) | Gibco | 11,140– 050 | in NK medium |
| Na-piruvato | Lonza | BE13-115E | in NK medium |
| Opera Phenix High-Content Analysis equipment | PerkinElmer, Waltham, MA, USA | HH14001000 | per HCA |
| PBS (soluzione salina tamponata con posfato) | Lonza | BE17-517Q | per il lavaggio delle cellule |
| Penicillina-Streptomicina | Biosera | LM-A4118 | JIMT-1-EGFP e NK medium |
| pLP-1, pLP-2, pLP-VSV-G, pWOXEGFP | Invitrogen, (Prof. Jó zsef T zsé r, Università di Debrecen) | per la linea cellulare JIMT-1-EGFP | |
| Pluronic-F127 | Sigma | P2443 | per il rivestimento della piastra HCS prima del trasferimento degli sferoidi |
| Sunitinib malato | SigmaAldrich | PZ0012 | per i trattamenti |
| Trastuzumab Ab (anticorpo monoclonale umanizzato anti-HER2) | Herzuma®, EGIS Pharmaceuticals, Budapest, Ungheria | NDC-63459-303-43 | per i trattamenti |
| Trastuzumab-F(ab')2 | Dono del Prof. Gyö rgy Vereb e Á rpá d Szö r | Dipartimento di Biofisica e Biologia Cellulare, Università di Debrecen | per trattamenti |
| Soluzione di blu di tripano 0,4% | Sigma | T8154 | per la conta cellulare |
| Tripsina-EDTA 1X in PBS | Biosiero | LM-T1706 | per il distacco di cellule |
Riferimenti
- Jubelin, C., et al. Three-dimensional in vitro culture models in oncology research. Cell Biosci. 12 (1), 155(2022).
- Mittler, F., et al. High-content monitoring of drug effects in a 3D spheroid model. Front Oncol. 7, 293(2017).
- Badr-Eldin,....
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Ristampe e permessi
