Valorisatie van het rode zeewier Gracilaria gracilis door middel van een bioraffinage-aanpak
Summary
Hier beschrijven we verschillende protocollen die gericht zijn op een geïntegreerde valorisatie van Gracilaria gracilis: het oogsten van wilde soorten, in-house groei en extractie van bioactieve ingrediënten. De antioxiderende, antimicrobiële en cytotoxische effecten van de extracten worden geëvalueerd, samen met de voedings- en stabiliteitsbeoordeling van voedsel verrijkt met hele zeewierbiomassa en pigmenten.
Abstract
De belangstelling voor zeewier als overvloedige grondstof om waardevolle en multitarget bioactieve ingrediënten te verkrijgen, groeit voortdurend. In dit werk onderzoeken we het potentieel van Gracilaria gracilis, een eetbaar rood zeewier dat wereldwijd wordt gekweekt vanwege zijn commerciële belang als bron van agar en andere ingrediënten voor cosmetische, farmacologische, voedsel- en diervoedertoepassingen.
De groeiomstandigheden van G. gracilis werden geoptimaliseerd door vegetatieve vermeerdering en sporulatie, terwijl de fysisch-chemische omstandigheden werden gemanipuleerd om een grote biomassavoorraad te verkrijgen. Groene extractiemethoden met ethanol en water werden uitgevoerd over de zeewierbiomassa. Het bioactieve potentieel van extracten werd beoordeeld door middel van een reeks in vitro testen met betrekking tot hun cytotoxiciteit, antioxiderende en antimicrobiële eigenschappen. Bovendien werd gedroogde zeewierbiomassa verwerkt in pastaformuleringen om de voedingswaarde van voedsel te verhogen. Pigmenten geëxtraheerd uit G. gracilis zijn ook in yoghurt verwerkt als een natuurlijke kleurstof en hun stabiliteit werd geëvalueerd. Beide producten werden onderworpen aan de beoordeling van een semi-getraind sensorisch panel met als doel de beste uiteindelijke formulering te bereiken voordat ze op de markt komen.
De resultaten ondersteunen de veelzijdigheid van G. gracilis , of het nu wordt toegepast als een hele biomassa, extracten en/of pigmenten. Door verschillende geoptimaliseerde protocollen te implementeren, maakt dit werk de ontwikkeling mogelijk van producten met het potentieel om de voedsel-, cosmetica- en aquacultuurmarkten te laten profiteren, ecologische duurzaamheid en een blauwe circulaire economie te bevorderen.
Bovendien, en in overeenstemming met een bioraffinagebenadering, zal de resterende biomassa van zeewier worden gebruikt als biostimulant voor plantengroei of worden omgezet in koolstofmaterialen voor gebruik in waterzuivering van de interne aquacultuursystemen van MARE-Polytechnic van Leiria, Portugal.
Introduction
Zeewier kan worden beschouwd als een interessante natuurlijke grondstof die kan worden gebruikt door de farmaceutische, voedings-, diervoeder- en milieusector. Ze biosynthetiseren een arsenaal aan moleculen, waarvan er vele niet worden aangetroffen in terrestrische organismen, met relevante biologische eigenschappen 1,2. Er moeten echter voor zeewier geoptimaliseerde teeltprotocollen worden geïmplementeerd om een grote biomassavoorraad te garanderen.
Bij de teeltmethoden moet altijd rekening worden gehouden met de aard van de zeewierthalli en de algehele morfologie. Gracilaria gracilis is een klonaal taxon, wat betekent dat het aanhechtingsorgaan meerdere vegetatieve assen produceert. Voortplanting door fragmentatie (vegetatieve voortplanting) wordt dus bereikt, aangezien elk van deze assen volledig in staat is om een onafhankelijk leven aan te nemen van het hoofdthallus3. Klonale taxa kunnen met succes worden geïntegreerd met eenvoudige en snelle kweekmethoden in één stap, aangezien grote hoeveelheden biomassa worden verkregen door het thallus te splitsen in kleine fragmenten die snel regenereren en uitgroeien tot nieuwe, genetisch identieke individuen. Zowel haplontische als diplontische thalli kunnen in dit proces worden gebruikt. Hoewel het geslacht een complexe haplo-diplontische isomorfe trifasische levenscyclus vertoont, is sporulatie zelden nodig, behalve wanneer genetische vernieuwing van de bestanden nodig is om verbeterde gewassen te verkrijgen. In dit geval geven zowel tetrasporen (haplontische sporen gevormd door meiose) als carpospores (diplontische sporen gevormd door mitose) aanleiding tot macroscopische thalli die vervolgens kunnen worden gekweekt en vermeerderd door vegetatieve voortplanting4. Groeicycli worden bepaald door omgevingsomstandigheden en de fysiologische toestand van de individuen, naast andere biologische factoren zoals het ontstaan van epifyten en de hechting van andere organismen. Daarom is het optimaliseren van de groeiomstandigheden cruciaal om een hoge productiviteit te garanderen en biomassa van goede kwaliteit te produceren5.
De extractie van bioactieve stoffen uit zeewier, waaronder G. gracilis, kan op verschillende manieren worden bereikt 6,7. De keuze van de extractiemethode hangt af van de specifieke verbindingen die van belang zijn, de beoogde toepassing en de kenmerken van het zeewier. In deze studie hebben we ons gericht op oplosmiddelextractie, waarbij groene oplosmiddelen, zoals water of ethanol, worden gebruikt om bioactieve stoffen op te lossen en te extraheren uit de zeewierbiomassa. De extractie kan op een veelzijdige en effectieve manier worden uitgevoerd door middel van maceratie en kan worden gebruikt voor een breed scala aan verbindingen. Het is een eenvoudige en veelgebruikte methode waarbij biomassa gedurende een langere periode in een oplosmiddel wordt geweekt, meestal bij kamertemperatuur of licht verhoogde temperaturen. Het oplosmiddel wordt geroerd om het extractieproces te verbeteren. Na de gewenste extractietijd wordt het oplosmiddel door filtratie of centrifugatie gescheiden van het vaste materiaal.
Water is een veelgebruikt oplosmiddel in voedingstoepassingen vanwege de veiligheid, beschikbaarheid en compatibiliteit met een breed scala aan voedingsproducten. Waterextractie is geschikt voor polaire verbindingen zoals polysachariden, peptiden en bepaalde fenolen. Het is echter mogelijk dat het niet-polaire verbindingen niet effectief extraheert. Ethanol is ook een veelgebruikt oplosmiddel in voedingstoepassingen en kan effectief zijn voor het extraheren van een verscheidenheid aan bioactieve moleculen, waaronder fenolische verbindingen, flavonoïden en bepaalde pigmenten. Ethanol wordt algemeen erkend als veilig voor gebruik in voedsel en kan gemakkelijk worden verdampt, waarbij de geëxtraheerde verbindingen achterblijven. Het is vermeldenswaard dat bij de keuze van de winningsmethode rekening moet worden gehouden met factoren als efficiëntie, selectiviteit, kosteneffectiviteit en milieu-impact. De optimalisatie van extractieparameters, zoals oplosmiddelconcentratie, extractietijd, temperatuur en druk, is cruciaal voor het bereiken van optimale opbrengsten van bioactieve stoffen uit G. gracilis of andere zeewieren.
Zeewieren blijken antimicrobiële activiteit te vertonen tegen een breed scala aan micro-organismen, waaronder bacteriën, schimmelsen virussen. Deze activiteit wordt toegeschreven aan bioactieve componenten, waaronder fenolen, polysachariden, peptiden en vetzuren. Verschillende studies hebben hun werkzaamheid aangetoond tegen ziekteverwekkers zoals onderandere Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella sp. en Pseudomonas aeruginosa. De antimicrobiële activiteit van zeewier wordt toegeschreven aan de aanwezigheid van bioactieve stoffen die kunnen interfereren met microbiële celwanden, membranen, enzymen en signaalroutes10. Deze verbindingen kunnen de microbiële groei verstoren, de vorming van biofilms remmen en immuunresponsen moduleren.
Rode zeewieren, ook wel rhodofyten genoemd, zijn een groep algen die antimicrobiële activiteit kunnen vertonen tegen een verscheidenheid aan micro-organismen. Binnen deze groep bevat G. gracilis verschillende bioactieve stoffen die kunnen bijdragen aan de gerapporteerde antimicrobiële activiteit. Hoewel de specifieke moleculen kunnen variëren, zijn de gemeenschappelijke klassen die zijn gerapporteerd in G. gracilis en mogelijk antimicrobiële eigenschappen bezitten, polysachariden, fenolen, terpenoïden en pigmenten11. Het is echter belangrijk op te merken dat de aanwezigheid en hoeveelheden van deze componenten kunnen variëren, afhankelijk van factoren zoals de locatie van zeewierverzameling, seizoensgebondenheid, fysiologische toestand van de thalli en omgevingsomstandigheden. Daarom kunnen de specifieke klasse en concentratie van antimicrobiële verbindingen in G. gracilis dienovereenkomstig variëren.
G. gracilis blijkt ook antioxiderende eigenschappen te hebben, die verschillende fenolische verbindingen bevatten, waarvan is aangetoond dat ze vrije radicalen opruimen en oxidatieve stress verminderen12.Antioxidanten helpen cellen te beschermen tegen schade veroorzaakt door reactieve zuurstofsoorten en hebben potentiële gezondheidsvoordelen. De antioxiderende capaciteit kan direct worden geëvalueerd door middel van verschillende methoden, waaronder de 2,2-difenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) vrije radicalenvanger en, indirect, door de kwantificering van het totale polyfenolgehalte (TPC)13.
Hoewel van een ingrediënt wordt gemeld dat het een prominente bioactiviteit heeft, is de cytotoxiciteitsbeoordeling ervan onmisbaar bij het beoordelen van natuurlijke en synthetische stoffen die in contact komen met levende cellen of weefsels. Er zijn verschillende methoden om cytotoxiciteit te meten, elk met voordelen en beperkingen. Over het algemeen bieden ze een scala aan opties om de schadelijke effecten van veel stoffen op cellen te evalueren en tegelijkertijd de mechanismen van celbeschadiging en -dood te onderzoeken14.
In dit werk gebruiken we de 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromide (MTT)-test, een colorimetrische methode geïntroduceerd door Mosmann (1983)15. Deze methode meet de reductie van tetrazoliumzouten tot een paars formazanproduct door metabolisch actieve cellen. Hoe hoger de hoeveelheid formazankristallen, hoe hoger het aantal levensvatbare cellen, waardoor een indirecte maat voor cytotoxiciteit wordt geboden14. Aangezien in dit werk G. gracilis water- en ethanolextracten bedoeld zijn om te worden opgenomen in dermocosmetische formuleringen, wordt de in vitro cytotoxiciteitsevaluatie uitgevoerd di een keratinocyt (HaCaT) cellijn.
Wat de voedseltoepassing betreft, bevatten zeewieren over het algemeen weinig calorieën en zijn ze qua voedingswaarde rijk aan voedingsvezels, essentiële elementen en aminozuren, polysachariden, meervoudig onverzadigde vetzuren, polyfenolen en vitamines 2,16. G. gracilis is geen uitzondering, met een interessante voedingswaarde. Freitas et al. (2021)4 ontdekten dat gekweekte G. gracilis hogere niveaus van eiwitten en vitamine C had en het niveau van totale lipiden handhaafde in vergelijking met wild zeewier. Dit kan een economisch en ecologisch voordeel opleveren, aangezien de productie uit voedingsoogpunt de voorkeur verdient boven de exploitatie van wilde hulpbronnen. Bovendien maken consumenten zich steeds meer zorgen over het soort voedsel dat ze eten, dus het is belangrijk om nieuwe ingrediënten voor voedselverrijking te introduceren en nieuwe middelen te gebruiken om extracten te verkrijgen die waarde kunnen toevoegen aan een product en een “clean label” kunnen claimen. Bovendien is de huidige markt zeer concurrerend, waardoor de ontwikkeling van nieuwe producten en innovatieve strategieën nodig zijn om fabrikanten van hun concurrenten te onderscheiden17.
De verrijking van producten met een slechte voedingswaarde, zoals pasta, met mariene hulpbronnen, waaronder zeewier, is een strategie om deze hulpbron als een nieuw voedingsmiddel te introduceren en een strategie voor marktdifferentiatie door middel van een product met een duidelijke voedingswaarde. Aan de andere kant is G. gracilis een bron van natuurlijke rode pigmenten zoals phycobiliproteïnen18, met een groot potentieel voor toepassingen in de voedingsindustrie. Dit zeewier heeft op verschillende gebieden grote belangstelling getoond en kan worden toegepast met behulp van het hele zeewier, extracten en/of de resterende biomassa. In dit werk demonstreren we enkele voorbeelden van dergelijke toepassingen.
Protocol
Representative Results
Discussion
De antimicrobiële activiteitstests in een vloeibaar medium worden gebruikt om de effectiviteit van antimicrobiële stoffen tegen micro-organismen gesuspendeerd in een vloeibaar medium te evalueren en worden meestal uitgevoerd om het vermogen van een stof te bepalen om de groei te remmen of micro-organismen te doden35,36,37,38. Ze worden gebruikt om de gevoeligheid van micro-organismen voor ant…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de Portugese Stichting voor Wetenschap en Technologie (FCT) via de strategische projecten die zijn toegekend aan MARE-Marine and Environmental Sciences Centre (UIDP/04292/2020 en UIDB/04292/2020) en Associate Laboratory ARNET (LA/P/0069/2020). FCT financierde ook de individuele doctoraatsbeurzen die werden toegekend aan Marta V. Freitas (UI/BD/150957/2021) en Tatiana Pereira (2021. 07791. BD). Deze werkzaamheden werden ook financieel ondersteund door het project HP4A – GEZONDE PASTA VOOR IEDEREEN (co-promotie nr. 039952), medegefinancierd door het EFRO – Europees Fonds voor Regionale Ontwikkeling, in het kader van het Portugal 2020-programma, via COMPETE 2020 – operationeel programma voor concurrentievermogen en internationalisering.
Materials
| Absolute Ethanol | Aga, Portugal | 64-17-5 | |
| Ammonium Chloride | PanReac | 12125-02-9 | |
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | 1397-89-3 | |
| Analytical scale balance | Sartorius, TE124S | 22105307 | |
| Bacillus subtilis subsp. spizizenii | German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ) | DSM 347 | |
| Biotin | Panreac AppliChem | 58-85-5 | |
| Centrifuge | Eppendorf, 5810R | 5811JH490481 | |
| Chloramphenicol | PanReac | 56-75-7 | |
| CO2 Chamber | Memmert | N/A | |
| Cool White Fluorescent Lamps | OSRAM Lumilux Skywhite | N/A | |
| Densitometer McFarland | Grant Instruments | N/A | |
| DMEM medium | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 67-68-5 | |
| DPPH | Sigma, Steinheim, Germany | 1898-66-4 | |
| Escherichia coli (DSM 5922) | German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ) | DSM5922 | |
| Ethanol 96% | AGA-Portugal | 64-17-5 | |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid Disodium Salt Dihydrate (Na2EDTA) | J.T.Baker | 6381-92-6 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| Filter Paper (Whatman No.1) | Whatman | WHA1001320 | |
| Flasks | VWR International, Alcabideche, Portugal | N/A | |
| Folin-Ciocalteu | VWR Chemicals | 31360.264 | |
| Gallic Acid | Merck | 149-91-7 | |
| Germanium (IV) Oxide, 99.999% | AlfaAesar | 1310-53-8 | |
| HaCaT cells – 300493 | CLS-Cell Lines Services, Germany | 300493 | |
| Hot Plate Magnetic Stirrer | IKA, C-MAG HS7 | 06.090564 | |
| Iron Sulfate | VWR Chemicals | 10124-49-9 | |
| Laminar flow hood | TelStar, Portugal | 526013 | |
| LB Medium | VWR Chemicals | J106 | |
| Listonella anguillarum | German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ) | DSM 21597 | |
| Manganese Chloride | VWR Chemicals | 7773.01.5 | |
| Micropipettes | Eppendorf, Portugal | N/A | |
| Microplates | VWR International, Alcabideche, Portugal | 10861-666 | |
| Microplates | Greiner | 738-0168 | |
| Microplates (sterile) | Fisher Scientific | 10022403 | |
| Microplate reader | Epoch Microplate Spectrophotometer, BioTek, Vermont, USA | 1611151E | |
| MTT | Sigma-Aldrich | 289-93-1 | |
| Muller-Hinton Broth (MHB) | VWR Chemicals | 90004-658 | |
| Oven | Binder, FD115 | 12-04490 | |
| Oven | Binder, BD115 | 04-62615 | |
| Penicillin | Sigma-Aldrich | 1406-05-9 | |
| pH meter Inolab | VWR International, Alcabideche, Portugal | 15212099 | |
| Pippete tips | Eppendorf, Portugal | 5412307 | |
| Pyrex Bottles Media Storage | VWR International, Alcabideche, Portugal | 16157-169 | |
| Rotary Evaporator | Heidolph, Laborota 4000 | 80409287 | |
| Rotavapor | IKA HB10, VWR International, Alcabideche, Portugal | 07.524254 | |
| Sodium Carbonate (Na2CO3) | Chem-Lab | 497-19-8 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Normax Chem | 7647-14-5 | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Riedel-de Haën | 7558-79-4 | |
| SpectraMagic NX | Konica Minolta, Japan | color data analysis software | |
| Spectrophotometer | Evolution 201, Thermo Scientific, Madison, WI, USA | 5A4T092004 | |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich | 57-92-1 | |
| Thiamine | Panreac AppliChem | 59-43-8 | |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T4049 | |
| Tryptic Soy Agar (TSA) | VWR Chemicals | ICNA091010617 | |
| Tryptic Soy Broth (TSB) | VWR Chemicals | 22091 | |
| Ultrapure water | Advantage A10 Milli-Q lab, Merck, Darmstadt, Germany | F5HA17360B | |
| Vacuum pump | Buchi, Switzerland | FIS05-402-103 | |
| Vitamin B12 | Merck | 68-19-9 |
Riferimenti
- Charoensiddhi, S., Abraham, R. E., Su, P., Zhang, W. Seaweed and seaweed-derived metabolites as prebiotics. Advances in Food and Nutrition Research. 91, 97-156 (2020).
- Roohinejad, S., Koubaa, M., Barba, F. J., Saljoughian, S., Amid, M., Greiner, R. Application of seaweeds to develop new food products with enhanced shelf-life, quality, and health-related beneficial properties. Food Research International. 99, 1066-1083 (2017).
- Hurd, C. L., Harrison, P. J., Bischof, K., Lobban, C. S. . Seaweed Ecology and Physiology. (second). , (2014).
- Freitas, M. V., Mouga, T., Correia, A. P., Afonso, C., Baptista, T. New insights on the sporulation, germination, and nutritional profile of Gracilaria gracilis (Rhodophyta) grown under controlled conditions. Journal of Marine Science and Engineering. 9 (6), 562 (2021).
- Friedlander, M. Advances in cultivation of Gelidiales. Journal of Applied Phycology. 20 (5), 451-456 (2008).
- Matos, G. S., Pereira, S. G., Genisheva, Z. A., Gomes, A. M., Teixeira, J. A., Rocha, C. M. R. Advances in extraction methods to recover added-value compounds from seaweeds: Sustainability and functionality. Foods. 10, 516 (2021).
- Ummat, V., Sivagnanam, S. P., Rajauria, G., O’Donnell, C., Tiwari, B. K. Advances in pre-treatment techniques and green extraction technologies for bioactives from seaweeds. Trends in Food Science & Technology. 110, 90-106 (2021).
- Pérez, M. J., Falqué, E., Domínguez, H., Ravishankar, G., Ambati, R. R. Seaweed Antimicrobials, Present Status and Future Perspectives. Handbook of Algal Technologies andPhytochemicals:Volume I Food, Health and Nutraceutical Applications. , (2019).
- Cavallo, R. A., Acquaviva, M. I., Stabili, L., Cecere, E., Petrocelli, A., Narracci, M. Antibacterial activity of marine macroalgae against fish pathogenic Vibrio species. Central European Journal of Biology. 8, 646-653 (2013).
- Shannon, E., Abu-Ghannam, N. Antibacterial derivatives of marine algae: An overview of pharmacological mechanisms and applications. Marine Drugs. 14 (4), 81 (2016).
- Capillo, G., et al. New insights into the culture method and antibacterial potential of Gracilaria gracilis. Marine Drugs. 16 (12), 492 (2018).
- Francavilla, M., Franchi, M., Monteleone, M., Caroppo, C. The red seaweed Gracilaria gracilis as a multi products source. Marine Drugs. 11 (10), 3754-3776 (2013).
- Sánchez-Ayora, H., Pérez-Jiménez, J., Pérez-Correa, J. R., Mateos, R., Domínguez, R. Antioxidant Capacity of Seaweeds: In Vitro and In Vivo Assessment. Marine Phenolic Compounds. , 299-341 (2023).
- Anil, S., Sweety, V. K., Vikas, B., Betsy-Joseph, B. . Cytotoxicity and Cell Viability Assessment of Biomaterials. Cytotoxicity. , 111822 (2023).
- Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
- Roleda, M. Y., et al. Variations in polyphenol and heavy metal contents of wild-harvested and cultivated seaweed bulk biomass: Health risk assessment and implication for food applications. Food Control. 95, 121-134 (2019).
- Souza, K. D., et al. Gastronomy and the development of new food products: Technological prospection. International Journal of Gastronomy and Food Science. 33, 100769 (2023).
- Pereira, T., et al. Optimization of phycobiliprotein pigments extraction from red algae Gracilaria gracilis for substitution of synthetic food colorants. Food Chemistry. 321, 126688 (2020).
- Redmond, S., Green, L., Yarish, C., Kim, J., Neefus, C., Redmond, S., Green, L., Yarish, C., Kim, J., Neefus, C. . New England Seaweed Culture Handbook-Nursery Systems. , (2014).
- Yong, Y. S., Yong, W. T. L., Anton, A. Analysis of formulae for determination of seaweed growth rate. Journal of Applied Phycology. 25 (6), 1831-1834 (2013).
- Patarra, R. F., Carreiro, A. S., Lloveras, A. A., Abreu, M. H., Buschmann, A. H., Neto, A. I. Effects of light, temperature and stocking density on Halopteris scoparia growth. Journal of Applied Phycology. 29 (1), 405-411 (2017).
- NCCLS, National Committee for Clinical Laboratory Standards, Clinical and Laboratory Standards Institute. . Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests: Approved Standard. 32, M02-M11 (2012).
- Singleton, V. L., Rossi, J. A. J. Colorimetry to total phenolics with phosphomolybdic acid reagents. American Journal of Enology and Viticulture. 16, 144-158 (1965).
- Duan, X. J., Zhang, W. W., Li, X. M., Wang, B. G. Evaluation of antioxidant property of extract and fractions obtained from a red alga, Polysiphonia urceolata. Food Chemistry. 95 (1), 37-43 (2006).
- Freitas, R., et al. Highlighting the biological potential of the brown seaweed Fucus spiralis for skin applications. Antioxidants. 9 (7), 611 (2020).
- Duarte, A., et al. Seasonal study of the nutritional composition of unexploited and low commercial value fish species from the Portuguese coast. Food Science and Nutrition. 10 (10), 3368-3379 (2020).
- Folch, J., Lees, M., Stanley, G. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).
- ISO 6865. Animal feeding stuffs – Determination of crude fibre content – Method with intermediate filtration. Bureau of Indian Standards (BIS). , (2000).
- Fernández, A., Grienke, U., Soler-Vila, A., Guihéneuf, F., Stengel, D. B., Tasdemir, D. Seasonal and geographical variations in the biochemical composition of the blue mussel (Mytilus edulis L.) from Ireland. Food Chemistry. 177, 43-52 (2015).
- Pinto, F., et al. Annual variations in the mineral element content of five fish species from the Portuguese coast. Food Research International. 158, 111482 (2022).
- Food energy – methods of analysis and conversion factors. Available from: https://www.fao.org/fileadmin/templates/food_composition/documents/book_abstracts/Food_energy.pdf (2003)
- . 1169/2011 of the European Parliament and of the Council of 25 -10-2011 Available from: https://eur-lex.europa.eu/legal-content/EN/ALL/?uri=CELEX%3A32011R1169 (2011)
- Pathare, P. B., Opara, U. L., Al-Said, F. A. J. Colour measurement and analysis in fresh and processed foods: A review. Food and Bioprocess Technology. 6 (1), 36-60 (2013).
- ISO 4120. Sensory analysis – Methodology – Triangle test. International Standard. , (2004).
- Reller, L. B., Weinstein, M., Jorgensen, J. H., Ferraro, M. J. Antimicrobial susceptibility testing: A review of general principles and contemporary practices. Clinical Infectious Diseases. 49 (11), 1749-1755 (2009).
- Balouiri, M., Sadiki, M., Ibnsouda, S. K. Methods for in vitro evaluating antimicrobial activity: A review. Journal of Pharmaceutical Analysis. 6 (2), 71-79 (2016).
- Gajic, I., et al. Antimicrobial susceptibility testing: A comprehensive review of currently used methods. Antibiotics. 11 (4), 427 (2022).
- Gonzalez-Pastor, R., et al. Current landscape of methods to evaluate antimicrobial activity of natural extracts. Molecules. 28 (3), 1068 (2023).
- Li, J., et al. Antimicrobial activity and resistance: Influencing factors. Frontiers in Pharmacology. 13 (8), 364 (2017).
- Silva, A., et al. Macroalgae as a source of valuable antimicrobial compounds: Extraction and applications. Antibiotics. 9 (10), 642 (2020).
- Munteanu, I. G., Apetrei, C. Analytical methods used in determining antioxidant activity: A review. International Journal of Molecular Sciences. 22 (7), 3380 (2021).
- Ma, S., et al. Comparison of common analytical methods for the quantification of total polyphenols and flavanols in fruit juices and ciders. Journal of Food Science. 84 (8), 2147-2158 (2019).
- Tziveleka, L. A., Tammam, M. A., Tzakou, O., Roussis, V., Ioannou, E. Metabolites with antioxidant activity from marine macroalgae. Antioxidants. 10 (9), 1431 (2021).
- Ghasemi, M., Turnbull, T., Sebastian, S., Kempson, I. The MTT assay: Utility, limitations, pitfalls, and interpretation in bulk and single-cell analysis. International Journal of Molecular Sciences. 22 (23), 12827 (2021).
- Pereira, T., Barroso, S., Mendes, S., Gil, M. M. Stability, kinetics, and application study of phycobiliprotein pigments extracted from red algae Gracilaria gracilis. Journal of Food Science. 85 (10), 3400-3405 (2020).
