Valorização da Alga Vermelha Gracilaria gracilis Através de uma Abordagem de Biorrefinaria
Summary
Aqui, descrevemos vários protocolos visando uma valorização integrada de Gracilaria gracilis: colheita de espécies silvestres, crescimento interno e extração de ingredientes bioativos. Os efeitos antioxidantes, antimicrobianos e citotóxicos dos extratos são avaliados, assim como a avaliação nutricional e de estabilidade de alimentos enriquecidos com biomassa e pigmentos integrais de algas marinhas.
Abstract
O interesse em algas marinhas como matéria-prima abundante para a obtenção de ingredientes bioativos valiosos e multialvos está crescendo continuamente. Neste trabalho, exploramos o potencial de Gracilaria gracilis, uma alga vermelha comestível cultivada mundialmente por seu interesse comercial como fonte de ágar e outros ingredientes para aplicações cosméticas, farmacológicas, alimentícias e de ração.
As condições de crescimento de G. gracilis foram otimizadas através da propagação vegetativa e esporulação, manipulando-se as condições físico-químicas para atingir um grande estoque de biomassa. Metodologias de extração verde com etanol e água foram realizadas sobre a biomassa de algas marinhas. O potencial bioativo dos extratos foi avaliado através de um conjunto de ensaios in vitro quanto à citotoxicidade, propriedades antioxidantes e antimicrobianas. Adicionalmente, biomassa seca de algas marinhas foi incorporada às formulações de massas alimentícias para aumentar o valor nutricional dos alimentos. Pigmentos extraídos de G. gracilis também foram incorporados ao iogurte como corante natural, e sua estabilidade foi avaliada. Ambos os produtos foram submetidos à apreciação de um painel sensorial semi-treinado visando alcançar a melhor formulação final antes de chegarem ao mercado.
Os resultados suportam a versatilidade de G. gracilis seja aplicado como biomassa inteira, extratos e/ou pigmentos. Através da implementação de vários protocolos otimizados, este trabalho permite o desenvolvimento de produtos com potencial para rentabilizar os mercados alimentar, cosmético e aquícola, promovendo a sustentabilidade ambiental e uma economia circular azul.
Além disso, e de acordo com uma abordagem de biorrefinaria, a biomassa residual de algas marinhas será utilizada como bioestimulante para o crescimento vegetal ou convertida em materiais de carbono para ser utilizada na purificação da água dos sistemas aquícolas internos do MARE-Politécnico de Leiria, Portugal.
Introduction
As algas marinhas podem ser consideradas uma matéria-prima natural interessante a ser aproveitada pelos setores farmacêutico, alimentício, de rações e ambiental. Biossintetizam uma panóplia de moléculas, muitas não encontradas em organismos terrestres, com propriedades biológicas relevantes 1,2. No entanto, protocolos de cultivo otimizados para algas marinhas precisam ser implementados para garantir um grande estoque de biomassa.
Os métodos de cultivo devem sempre considerar a natureza do talo de algas marinhas e a morfologia geral. Gracilaria gracilis é um táxon clonal, o que significa que o órgão de ligação produz múltiplos eixos vegetativos. A propagação por fragmentação (reprodução vegetativa) é assim alcançada, pois cada um desses eixos é plenamente capaz de adotar uma vida independente do talo principal3. Os táxons clonais podem ser integrados com sucesso com metodologias simples e rápidas de cultivo em uma etapa, pois grandes quantidades de biomassa são obtidas dividindo o talo em pequenos fragmentos que rapidamente se regeneram e crescem em novos indivíduos geneticamente idênticos. Tanto o talo haplontico quanto o diplontico podem ser utilizados nesse processo. Embora o gênero exiba um complexo ciclo de vida trifásico isomórfico haplo-diplontic, a esporulação raramente é necessária, exceto quando a renovação genética dos estoques é necessária para alcançar culturas melhoradas. Nesse caso, tanto os tetrasporos (esporos haplônicos formados pela meiose) quanto os carposporos (esporos diplonticos formados pela mitose) dão origem aos talos macroscópicos que podem ser cultivados e propagados pela reprodução vegetativa4. Os ciclos de crescimento são ditados pelas condições ambientais e pelo estado fisiológico dos indivíduos, entre outros fatores biológicos, como o surgimento de epífitas e a adesão de outros organismos. Portanto, otimizar as condições de cultivo é crucial para garantir alta produtividade e produzir biomassa de boa qualidade5.
A extração de compostos bioativos de algas marinhas, incluindo G. gracilis, pode ser obtida através de vários métodos 6,7. A escolha do método de extração depende dos compostos específicos de interesse, da aplicação alvo e das características da alga. Neste estudo, focamos na extração por solvente, que envolve o uso de solventes verdes, como água ou etanol, para dissolver e extrair compostos bioativos da biomassa de algas marinhas. A extração pode ser realizada através de maceração de forma versátil e eficaz e pode ser utilizada para uma ampla gama de compostos. É um método simples e amplamente utilizado que envolve a imersão de biomassa em um solvente por um período prolongado, tipicamente em temperaturas ambientes ou ligeiramente elevadas. O solvente é agitado para melhorar o processo de extração. Após o tempo de extração desejado, o solvente é separado do material sólido por filtração ou centrifugação.
A água é um solvente comumente usado em aplicações alimentares devido à sua segurança, disponibilidade e compatibilidade com uma ampla gama de produtos alimentícios. A extração de água é adequada para compostos polares como polissacarídeos, peptídeos e certos fenólicos. No entanto, pode não extrair eficazmente compostos apolares. O etanol também é um solvente amplamente utilizado em aplicações alimentares e pode ser eficaz para extrair uma variedade de moléculas bioativas, incluindo compostos fenólicos, flavonoides e certos pigmentos. O etanol é geralmente reconhecido como seguro para uso em alimentos e pode ser facilmente evaporado, deixando para trás os compostos extraídos. Vale ressaltar que a escolha do método de extração deve considerar fatores como eficiência, seletividade, custo-efetividade e impacto ambiental. A otimização dos parâmetros de extração, tais como concentração de solvente, tempo de extração, temperatura e pressão, é crucial para alcançar rendimentos ideais de compostos bioativos de G. gracilis ou outras algas marinhas.
Descobriu-se que as algas marinhas exibem atividade antimicrobiana contra uma ampla gama de microrganismos, incluindo bactérias, fungos e vírus8. Essa atividade é atribuída a componentes bioativos, incluindo fenólicos, polissacarídeos, peptídeos e ácidos graxos. Vários estudos têm demonstrado sua eficácia contra patógenos como Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella sp., Pseudomonas aeruginosa, entreoutros9. A atividade antimicrobiana das algas marinhas é atribuída à presença de compostos bioativos que podem interferir na parede celular microbiana, membranas, enzimas e vias de sinalização10. Esses compostos podem interromper o crescimento microbiano, inibir a formação de biofilme e modular as respostas imunes.
As algas vermelhas, também conhecidas como rodófitas, são um grupo de algas que podem apresentar atividade antimicrobiana contra uma variedade de microrganismos. Dentro deste grupo, G. gracilis contém vários compostos bioativos que podem contribuir para sua atividade antimicrobiana relatada. Embora as moléculas específicas possam variar, as classes comuns que têm sido relatadas em G. gracilis e podem possuir propriedades antimicrobianas são polissacarídeos, fenólicos, terpenóides e pigmentos11. No entanto, é importante notar que a presença e a quantidade desses componentes podem variar dependendo de fatores como o local de coleta das algas, sazonalidade, condição fisiológica dos talos e condições ambientais. Portanto, a classe específica e a concentração de compostos antimicrobianos em G. gracilis podem variar de acordo.
G. gracilis também possui propriedades antioxidantes, contendo vários compostos fenólicos, que demonstraram eliminar radicais livres e reduzir o estresse oxidativo12.Os antioxidantes ajudam a proteger as células dos danos causados por espécies reativas de oxigênio e têm potenciais benefícios para a saúde. A capacidade antioxidante pode ser avaliada diretamente através de diferentes métodos, incluindo a atividade sequestradora do radical livre 2,2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH) e, indiretamente, através da quantificação do conteúdo polifenólico total (TPC)13.
Embora um ingrediente tenha uma bioatividade proeminente, sua avaliação da citotoxicidade é indispensável na avaliação de substâncias naturais e sintéticas a serem usadas em contato com células ou tecidos vivos. Existem vários métodos para medir a citotoxicidade, cada um com vantagens e limitações. De modo geral, oferecem uma gama de opções para avaliar os efeitos nocivos de muitas substâncias sobre as células e, ao mesmo tempo, investigar os mecanismos de dano e morte celular14.
Neste trabalho, utilizamos o ensaio de brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio (MTT), método colorimétrico introduzido por Mosmann (1983)15. Este método mede a redução de sais de tetrazólio a um produto de formazana roxa por células metabolicamente ativas. Quanto maior a quantidade de cristais de formazana, maior o número de células viáveis, proporcionando uma medida indireta de citotoxicidade14. Como neste trabalho os extratos aquoso e etanólico de G. gracilis pretendem ser incorporados em formulações dermocosméticas, a avaliação in vitro da citotoxicidade é realizada em uma linhagem celular de queratinócitos (HaCaT).
Quanto à aplicação alimentar, as algas marinhas são geralmente pobres em calorias e nutricionalmente ricas em fibras alimentares, elementos essenciais e aminoácidos, polissacarídeos, ácidos graxos poli-insaturados, polifenóis e vitaminas 2,16. G. gracilis não é exceção, tendo um valor nutricional interessante. (2021)4 verificaram que G. gracilis cultivada apresentou maiores níveis de proteína e vitamina C e manteve o nível de lipídios totais em relação às algas silvestres. Isso pode representar uma vantagem econômica e ambiental, pois nutricionalmente falando, a produção é preferível à exploração de recursos silvestres. Além disso, os consumidores estão cada vez mais preocupados com o tipo de alimento que comem, por isso é importante introduzir novos ingredientes para o enriquecimento alimentar e usar novos recursos para obter extratos que possam agregar valor a um produto e reivindicar um “rótulo limpo”. Além disso, o mercado atual é bastante competitivo, exigindo o desenvolvimento de novos produtos e estratégias inovadoras para diferenciar os fabricantes de seus concorrentes17.
O enriquecimento de produtos de baixo valor nutricional, como as massas, com recursos marinhos, incluindo algas marinhas, é uma estratégia para introduzir este recurso como um novo alimento e uma estratégia de diferenciação de mercado através de um produto com valor nutricional distinto. Por outro lado, G. gracilis é fonte de pigmentos vermelhos naturais, como as ficobiliproteínas18, apresentando alto potencial para aplicações na indústria de alimentos. Esta alga tem demonstrado grande interesse em diversas áreas, e sua aplicação pode ser feita utilizando a totalidade das algas, extratos e/ou a biomassa remanescente. Neste trabalho, demonstramos alguns exemplos de tais aplicações.
Protocol
Representative Results
Discussion
Os testes de atividade antimicrobiana em meio líquido são utilizados para avaliar a eficácia de substâncias antimicrobianas contra microrganismos suspensos em meio líquido e geralmente são realizados para determinar a capacidade de uma substância inibir o crescimento ou matar microrganismos35,36,37,38. São utilizados para avaliar a sensibilidade de microrganismos a agentes antimicrobian…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pela Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT) através dos Projetos Estratégicos atribuídos ao MARE-Centro de Ciências do Mar e do Ambiente (UIDP/04292/2020 e UIDB/04292/2020), e ao Laboratório Associado ARNET (LA/P/0069/2020). A FCT também financiou as bolsas individuais de doutoramento atribuídas a Marta V. Freitas (UI/BD/150957/2021) e Tatiana Pereira (2021). 07791. BD). Este trabalho foi também financiado pelo projeto HP4A – MASSA SAUDÁVEL PARA TODOS (copromoção n.º 039952), cofinanciado pelo FEDER – Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional, no âmbito do Programa Portugal 2020, através do Programa COMPETE 2020 – Programa Operacional Competitividade e Internacionalização.
Materials
| Absolute Ethanol | Aga, Portugal | 64-17-5 | |
| Ammonium Chloride | PanReac | 12125-02-9 | |
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | 1397-89-3 | |
| Analytical scale balance | Sartorius, TE124S | 22105307 | |
| Bacillus subtilis subsp. spizizenii | German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ) | DSM 347 | |
| Biotin | Panreac AppliChem | 58-85-5 | |
| Centrifuge | Eppendorf, 5810R | 5811JH490481 | |
| Chloramphenicol | PanReac | 56-75-7 | |
| CO2 Chamber | Memmert | N/A | |
| Cool White Fluorescent Lamps | OSRAM Lumilux Skywhite | N/A | |
| Densitometer McFarland | Grant Instruments | N/A | |
| DMEM medium | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 67-68-5 | |
| DPPH | Sigma, Steinheim, Germany | 1898-66-4 | |
| Escherichia coli (DSM 5922) | German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ) | DSM5922 | |
| Ethanol 96% | AGA-Portugal | 64-17-5 | |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid Disodium Salt Dihydrate (Na2EDTA) | J.T.Baker | 6381-92-6 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| Filter Paper (Whatman No.1) | Whatman | WHA1001320 | |
| Flasks | VWR International, Alcabideche, Portugal | N/A | |
| Folin-Ciocalteu | VWR Chemicals | 31360.264 | |
| Gallic Acid | Merck | 149-91-7 | |
| Germanium (IV) Oxide, 99.999% | AlfaAesar | 1310-53-8 | |
| HaCaT cells – 300493 | CLS-Cell Lines Services, Germany | 300493 | |
| Hot Plate Magnetic Stirrer | IKA, C-MAG HS7 | 06.090564 | |
| Iron Sulfate | VWR Chemicals | 10124-49-9 | |
| Laminar flow hood | TelStar, Portugal | 526013 | |
| LB Medium | VWR Chemicals | J106 | |
| Listonella anguillarum | German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ) | DSM 21597 | |
| Manganese Chloride | VWR Chemicals | 7773.01.5 | |
| Micropipettes | Eppendorf, Portugal | N/A | |
| Microplates | VWR International, Alcabideche, Portugal | 10861-666 | |
| Microplates | Greiner | 738-0168 | |
| Microplates (sterile) | Fisher Scientific | 10022403 | |
| Microplate reader | Epoch Microplate Spectrophotometer, BioTek, Vermont, USA | 1611151E | |
| MTT | Sigma-Aldrich | 289-93-1 | |
| Muller-Hinton Broth (MHB) | VWR Chemicals | 90004-658 | |
| Oven | Binder, FD115 | 12-04490 | |
| Oven | Binder, BD115 | 04-62615 | |
| Penicillin | Sigma-Aldrich | 1406-05-9 | |
| pH meter Inolab | VWR International, Alcabideche, Portugal | 15212099 | |
| Pippete tips | Eppendorf, Portugal | 5412307 | |
| Pyrex Bottles Media Storage | VWR International, Alcabideche, Portugal | 16157-169 | |
| Rotary Evaporator | Heidolph, Laborota 4000 | 80409287 | |
| Rotavapor | IKA HB10, VWR International, Alcabideche, Portugal | 07.524254 | |
| Sodium Carbonate (Na2CO3) | Chem-Lab | 497-19-8 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Normax Chem | 7647-14-5 | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Riedel-de Haën | 7558-79-4 | |
| SpectraMagic NX | Konica Minolta, Japan | color data analysis software | |
| Spectrophotometer | Evolution 201, Thermo Scientific, Madison, WI, USA | 5A4T092004 | |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich | 57-92-1 | |
| Thiamine | Panreac AppliChem | 59-43-8 | |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T4049 | |
| Tryptic Soy Agar (TSA) | VWR Chemicals | ICNA091010617 | |
| Tryptic Soy Broth (TSB) | VWR Chemicals | 22091 | |
| Ultrapure water | Advantage A10 Milli-Q lab, Merck, Darmstadt, Germany | F5HA17360B | |
| Vacuum pump | Buchi, Switzerland | FIS05-402-103 | |
| Vitamin B12 | Merck | 68-19-9 |
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