Kırmızı Deniz Yosunu Gracilaria gracilis'in Biyorafineri Yaklaşımı ile Değerlendirilmesi
Summary
Burada, Gracilaria gracilis’in entegre bir şekilde değerlendirilmesini amaçlayan birkaç protokolü açıklıyoruz: yabani türlerin toplanması, kurum içi büyüme ve biyoaktif bileşenlerin ekstraksiyonu. Ekstraktların antioksidan, antimikrobiyal ve sitotoksik etkileri, bütün deniz yosunu biyokütlesi ve pigmentleri ile zenginleştirilmiş gıdaların beslenme ve stabilite değerlendirmesi ile birlikte değerlendirilir.
Abstract
Değerli ve çok hedefli biyoaktif bileşenler elde etmek için bol miktarda hammadde olarak deniz yosunlarına olan ilgi sürekli artmaktadır. Bu çalışmada, kozmetik, farmakolojik, gıda ve yem uygulamaları için bir agar ve diğer bileşenlerin kaynağı olarak ticari çıkarları nedeniyle dünya çapında yetiştirilen yenilebilir bir kırmızı deniz yosunu olan Gracilaria gracilis’in potansiyelini araştırıyoruz.
G. gracilis büyüme koşulları, büyük bir biyokütle stoğu elde etmek için fizikokimyasal koşulları manipüle ederken vejetatif çoğaltma ve sporülasyon yoluyla optimize edildi. Deniz yosunu biyokütlesi üzerinde etanol ve su ile yeşil ekstraksiyon metodolojileri gerçekleştirildi. Ekstraktların biyoaktif potansiyeli, sitotoksisiteleri, antioksidanları ve antimikrobiyal özellikleri ile ilgili bir dizi in vitro test ile değerlendirildi. Ek olarak, kurutulmuş deniz yosunu biyokütlesi, gıdanın besin değerini artırmak için makarna formülasyonlarına dahil edildi. G. gracilis’ten ekstrakte edilen pigmentler de doğal bir renklendirici olarak yoğurda dahil edilmiş ve stabiliteleri değerlendirilmiştir. Her iki ürün de pazara ulaşmadan önce en iyi nihai formülasyonu elde etmeyi amaçlayan yarı eğitimli bir duyusal panelin takdirine sunuldu.
Sonuçlar, G. gracilis’in bütün bir biyokütle, ekstrakt ve/veya pigment olarak uygulanıp uygulanmadığına bakılmaksızın çok yönlülüğünü desteklemektedir. Bu çalışma, birkaç optimize edilmiş protokolün uygulanmasıyla, gıda, kozmetik ve su ürünleri pazarlarından kâr etme potansiyeline sahip ürünlerin geliştirilmesine olanak tanıyarak çevresel sürdürülebilirliği ve mavi döngüsel ekonomiyi teşvik eder.
Ayrıca, bir biyorafineri yaklaşımına uygun olarak, artık deniz yosunu biyokütlesi, bitki büyümesi için biyostimülan olarak kullanılacak veya Leiria, Portekiz’deki MARE-Polytechnic’in kurum içi su ürünleri yetiştiriciliği sistemlerinin su arıtmasında kullanılmak üzere karbon malzemelerine dönüştürülecektir.
Introduction
Deniz yosunları, ilaç, gıda, yem ve çevre sektörleri tarafından yararlanılacak ilginç bir doğal hammadde olarak kabul edilebilir. Birçoğu karasal organizmalarda bulunmayan ve ilgili biyolojik özelliklere sahip bir dizi molekülü biyosentezlerler 1,2. Bununla birlikte, büyük bir biyokütle stoğu sağlamak için deniz yosunu için optimize edilmiş yetiştirme protokollerinin uygulanması gerekir.
Yetiştirme yöntemleri her zaman deniz yosunu thalli’nin doğasını ve genel morfolojisini dikkate almalıdır. Gracilaria gracilis klonal bir taksondur, yani bağlanma organı birden fazla vejetatif eksen üretir. Parçalanma (vejetatif üreme) yoluyla çoğaltma böylece elde edilir, çünkü bu eksenlerin her biri ana thallus3’ten bağımsız bir yaşamı tamamen benimseyebilir. Klonal taksonlar, basit ve hızlı tek adımlı yetiştirme metodolojileriyle başarılı bir şekilde entegre edilebilir, çünkü büyük miktarlarda biyokütle, thallusun hızla yenilenen ve yeni, genetik olarak özdeş bireylere dönüşen küçük parçalara bölünmesiyle elde edilir. Bu süreçte hem haplontik hem de diplontik thalli kullanılabilir. Cins, karmaşık bir haplo-diplontik izomorfik trifazik yaşam döngüsü sergilemesine rağmen, gelişmiş mahsuller elde etmek için stokların genetik yenilenmesinin gerekli olduğu durumlar dışında, sporülasyon nadiren gereklidir. Bu durumda, hem tetrasporlar (mayoz bölünme tarafından oluşturulan haplontik sporlar) hem de karposporlar (mitoz tarafından oluşturulan diplontik sporlar), daha sonra vejetatif üreme ile yetiştirilebilen ve çoğaltılabilen makroskopik thallilere yol açar4. Büyüme döngüleri, epifitlerin ortaya çıkması ve diğer organizmaların yapışması gibi diğer biyolojik faktörlerin yanı sıra çevresel koşullar ve bireylerin fizyolojik durumu tarafından belirlenir. Bu nedenle, yüksek verimlilik sağlamak ve kaliteli biyokütle üretmek için yetiştirme koşullarını optimize etmek çok önemlidir5.
G. gracilis de dahil olmak üzere deniz yosunundan biyoaktif bileşiklerin ekstraksiyonu çeşitli yöntemlerle gerçekleştirilebilir 6,7. Ekstraksiyon yönteminin seçimi, ilgilenilen spesifik bileşiklere, hedef uygulamaya ve deniz yosununun özelliklerine bağlıdır. Bu çalışmada, deniz yosunu biyokütlesinden biyoaktif bileşikleri çözmek ve çıkarmak için su veya etanol gibi yeşil çözücülerin kullanılmasını içeren çözücü ekstraksiyonuna odaklandık. Ekstraksiyon, maserasyon yoluyla çok yönlü ve etkili bir şekilde gerçekleştirilebilir ve çok çeşitli bileşikler için kullanılabilir. Biyokütlenin bir çözücü içinde uzun bir süre, tipik olarak oda veya biraz yüksek sıcaklıklarda bekletilmesini içeren basit ve yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. Ekstraksiyon işlemini geliştirmek için çözücü karıştırılır. İstenilen ekstraksiyon süresinden sonra çözücü, filtrasyon veya santrifüjleme ile katı malzemeden ayrılır.
Su, güvenliği, bulunabilirliği ve çok çeşitli gıda ürünleriyle uyumluluğu nedeniyle gıda uygulamalarında yaygın olarak kullanılan bir çözücüdür. Su ekstraksiyonu, polisakkaritler, peptitler ve bazı fenolikler gibi polar bileşikler için uygundur. Bununla birlikte, polar olmayan bileşikleri etkili bir şekilde çıkaramayabilir. Etanol ayrıca gıda uygulamalarında yaygın olarak kullanılan bir çözücüdür ve fenolik bileşikler, flavonoidler ve belirli pigmentler dahil olmak üzere çeşitli biyoaktif moleküllerin ekstraksiyonunda etkili olabilir. Etanol genellikle gıdalarda kullanım için güvenli olarak kabul edilir ve ekstrakte edilen bileşikleri geride bırakarak kolayca buharlaştırılabilir. Ekstraksiyon yöntemi seçiminin verimlilik, seçicilik, maliyet etkinliği ve çevresel etki gibi faktörleri dikkate alması gerektiğini belirtmekte fayda var. Çözücü konsantrasyonu, ekstraksiyon süresi, sıcaklık ve basınç gibi ekstraksiyon parametrelerinin optimizasyonu, G. gracilis veya diğer deniz yosunlarından biyoaktif bileşiklerin optimum verimini elde etmek için çok önemlidir.
Deniz yosunlarının bakteriler, mantarlar ve virüsler dahil olmak üzere çok çeşitli mikroorganizmalara karşı antimikrobiyal aktivite sergilediği bulunmuştur8. Bu aktivite, fenolikler, polisakkaritler, peptitler ve yağ asitleri dahil olmak üzere biyoaktif bileşenlere atfedilir. Çeşitli çalışmalar, diğerlerinin yanı sıra Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella sp. ve Pseudomonas aeruginosa gibi patojenlere karşı etkinliklerini göstermiştir9. Deniz yosunlarının antimikrobiyal aktivitesi, mikrobiyal hücre duvarlarına, zarlara, enzimlere ve sinyal yollarına müdahale edebilen biyoaktif bileşiklerin varlığına atfedilir10. Bu bileşikler mikrobiyal büyümeyi bozabilir, biyofilm oluşumunu engelleyebilir ve bağışıklık tepkilerini modüle edebilir.
Ormangülü olarak da bilinen kırmızı deniz yosunları, çeşitli mikroorganizmalara karşı antimikrobiyal aktivite gösterebilen bir alg grubudur. Bu grup içinde, G. gracilis , bildirilen antimikrobiyal aktivitesine katkıda bulunabilecek çeşitli biyoaktif bileşikler içerir. Spesifik moleküller değişebilse de, G. gracilis’te bildirilen ve antimikrobiyal özelliklere sahip olabilen ortak sınıflar polisakkaritler, fenolikler, terpenoidler ve pigmentlerdir11. Bununla birlikte, bu bileşenlerin varlığının ve miktarlarının deniz yosununun toplandığı yer, mevsimsellik, talinin fizyolojik durumu ve çevresel koşullar gibi faktörlere bağlı olarak değişebileceğini unutmamak önemlidir. Bu nedenle, G. gracilis’teki antimikrobiyal bileşiklerin spesifik sınıfı ve konsantrasyonu buna göre değişebilir.
G. gracilis’in ayrıca serbest radikalleri temizlediği ve oksidatif stresi azalttığı gösterilen çeşitli fenolik bileşikler içeren antioksidan özelliklere sahip olduğu bulunmuştur12.Antioksidanlar, hücreleri reaktif oksijen türlerinin neden olduğu hasarlardan korumaya yardımcı olur ve potansiyel sağlık yararları vardır. Antioksidan kapasite, 2,2-difenil-1-pikrilhidrazil (DPPH) serbest radikal süpürücü aktivitesi dahil olmak üzere farklı yöntemlerle doğrudan ve dolaylı olarak toplam polifenolik içeriğin (TPC) miktarının belirlenmesi yoluyla değerlendirilebilir13.
Bir bileşenin belirgin bir biyoaktiviteye sahip olduğu bildirilse de, sitotoksisite değerlendirmesi, canlı hücreler veya dokularla temas halinde kullanılacak doğal ve sentetik maddelerin değerlendirilmesinde vazgeçilmezdir. Sitotoksisiteyi ölçmek için her biri avantajları ve sınırlamaları olan birkaç yöntem vardır. Genel olarak, birçok maddenin hücreler üzerindeki zararlı etkilerini değerlendirmek ve aynı zamanda hücre hasarı ve ölüm mekanizmalarını araştırmak için bir dizi seçenek sunarlar14.
Bu çalışmada, Mosmann (1983)15 tarafından tanıtılan kolorimetrik bir yöntem olan 3-(4,5-dimetiltiyazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolyum bromür (MTT) testini kullanıyoruz. Bu yöntem, tetrazolyum tuzlarının metabolik olarak aktif hücreler tarafından mor bir formazan ürününe indirgenmesini ölçer. Formazan kristallerinin miktarı ne kadar yüksek olursa, canlı hücrelerin sayısı da o kadar yüksek olur, böylece dolaylı bir sitotoksisiteölçüsü sağlanır 14. Bu çalışmada, G. gracilis su ve etanol ekstraktlarının dermo-kozmetik formülasyonlara dahil edilmesi amaçlandığından, in vitro sitotoksisite değerlendirmesi bir keratinosit (HaCaT) hücre hattında gerçekleştirilir.
Gıda uygulamasıyla ilgili olarak, deniz yosunları genellikle kalorileri düşüktür ve diyet lifleri, esansiyel elementler ve amino asitler, polisakkaritler, çoklu doymamış yağ asitleri, polifenoller ve vitaminleraçısından besleyici açıdan zengindir 2,16. G. gracilis, ilginç bir besin değerine sahip bir istisna değildir. Freitas ve ark. (2021)4, ekili G. gracilis’in yabani deniz yosununa kıyasla daha yüksek protein ve C vitamini seviyelerine sahip olduğunu ve toplam lipit seviyesini koruduğunu buldu. Bu, ekonomik ve çevresel bir avantajı temsil edebilir, çünkü beslenme açısından konuşursak, üretim vahşi kaynakların sömürülmesine tercih edilir. Buna ek olarak, tüketiciler yedikleri yiyeceklerin türü hakkında giderek daha fazla endişe duyuyorlar, bu nedenle gıda zenginleştirme için yeni bileşenler sunmak ve bir ürüne değer katabilecek ve “temiz bir etiket” talep edebilecek özler elde etmek için yeni kaynaklar kullanmak önemlidir. Ayrıca, mevcut pazar çok rekabetçidir ve üreticileri rakiplerinden farklılaştırmak için yeni ürünlerin ve yenilikçi stratejilerin geliştirilmesini gerektirir17.
Makarna gibi besin değeri düşük olan ürünlerin deniz yosunu da dahil olmak üzere deniz kaynakları ile zenginleştirilmesi, bu kaynağın yeni bir gıda olarak tanıtılması ve farklı besin değerine sahip bir ürün aracılığıyla pazarda farklılaşma stratejisidir. Öte yandan, G. gracilis , gıda endüstrisindeki uygulamalar için yüksek potansiyele sahip, ficobiliproteinler18 gibi doğal kırmızı pigmentlerin kaynağıdır. Bu deniz yosunu birçok alanda büyük ilgi görmüştür ve uygulaması tüm deniz yosunu, özler ve/veya kalan biyokütle kullanılarak yapılabilir. Bu çalışmada, bu tür uygulamaların bazı örneklerini gösteriyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sıvı bir ortamda antimikrobiyal aktivite testleri, antimikrobiyal maddelerin sıvı bir ortamda asılı kalan mikroorganizmalara karşı etkinliğini değerlendirmek için kullanılmaktadır ve genellikle bir maddenin büyümeyi engelleme veya mikroorganizmaları öldürme yeteneğini belirlemek için yapılmaktadır35,36,37,38. Mikroorganizmaların antimikrobiyal ajanlara duyarlılığını …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Portekiz Bilim ve Teknoloji Vakfı (FCT) tarafından MARE-Deniz ve Çevre Bilimleri Merkezi’ne (UIDP/04292/2020 ve UIDB/04292/2020) ve Ortak Laboratuvar ARNET’e (LA/P/0069/2020) verilen Stratejik Projeler aracılığıyla desteklenmiştir. FCT ayrıca Marta V. Freitas (UI/BD/150957/2021) ve Tatiana Pereira’ya (2021) verilen bireysel doktora hibelerini de finanse etti. 07791. BD). Bu çalışma aynı zamanda Portekiz 2020 Programı kapsamında ERDF – Avrupa Bölgesel Kalkınma Fonu tarafından ortaklaşa finanse edilen HP4A – HERKES IÇIN SAĞLIKLI MAKARNA (ortak tanıtım no. 039952) projesi tarafından COMPETE 2020 – Rekabet Edebilirlik ve Uluslararasılaşma Operasyonel Programı aracılığıyla finansal olarak desteklenmiştir.
Materials
| Absolute Ethanol | Aga, Portugal | 64-17-5 | |
| Ammonium Chloride | PanReac | 12125-02-9 | |
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | 1397-89-3 | |
| Analytical scale balance | Sartorius, TE124S | 22105307 | |
| Bacillus subtilis subsp. spizizenii | German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ) | DSM 347 | |
| Biotin | Panreac AppliChem | 58-85-5 | |
| Centrifuge | Eppendorf, 5810R | 5811JH490481 | |
| Chloramphenicol | PanReac | 56-75-7 | |
| CO2 Chamber | Memmert | N/A | |
| Cool White Fluorescent Lamps | OSRAM Lumilux Skywhite | N/A | |
| Densitometer McFarland | Grant Instruments | N/A | |
| DMEM medium | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 67-68-5 | |
| DPPH | Sigma, Steinheim, Germany | 1898-66-4 | |
| Escherichia coli (DSM 5922) | German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ) | DSM5922 | |
| Ethanol 96% | AGA-Portugal | 64-17-5 | |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid Disodium Salt Dihydrate (Na2EDTA) | J.T.Baker | 6381-92-6 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| Filter Paper (Whatman No.1) | Whatman | WHA1001320 | |
| Flasks | VWR International, Alcabideche, Portugal | N/A | |
| Folin-Ciocalteu | VWR Chemicals | 31360.264 | |
| Gallic Acid | Merck | 149-91-7 | |
| Germanium (IV) Oxide, 99.999% | AlfaAesar | 1310-53-8 | |
| HaCaT cells – 300493 | CLS-Cell Lines Services, Germany | 300493 | |
| Hot Plate Magnetic Stirrer | IKA, C-MAG HS7 | 06.090564 | |
| Iron Sulfate | VWR Chemicals | 10124-49-9 | |
| Laminar flow hood | TelStar, Portugal | 526013 | |
| LB Medium | VWR Chemicals | J106 | |
| Listonella anguillarum | German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ) | DSM 21597 | |
| Manganese Chloride | VWR Chemicals | 7773.01.5 | |
| Micropipettes | Eppendorf, Portugal | N/A | |
| Microplates | VWR International, Alcabideche, Portugal | 10861-666 | |
| Microplates | Greiner | 738-0168 | |
| Microplates (sterile) | Fisher Scientific | 10022403 | |
| Microplate reader | Epoch Microplate Spectrophotometer, BioTek, Vermont, USA | 1611151E | |
| MTT | Sigma-Aldrich | 289-93-1 | |
| Muller-Hinton Broth (MHB) | VWR Chemicals | 90004-658 | |
| Oven | Binder, FD115 | 12-04490 | |
| Oven | Binder, BD115 | 04-62615 | |
| Penicillin | Sigma-Aldrich | 1406-05-9 | |
| pH meter Inolab | VWR International, Alcabideche, Portugal | 15212099 | |
| Pippete tips | Eppendorf, Portugal | 5412307 | |
| Pyrex Bottles Media Storage | VWR International, Alcabideche, Portugal | 16157-169 | |
| Rotary Evaporator | Heidolph, Laborota 4000 | 80409287 | |
| Rotavapor | IKA HB10, VWR International, Alcabideche, Portugal | 07.524254 | |
| Sodium Carbonate (Na2CO3) | Chem-Lab | 497-19-8 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Normax Chem | 7647-14-5 | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Riedel-de Haën | 7558-79-4 | |
| SpectraMagic NX | Konica Minolta, Japan | color data analysis software | |
| Spectrophotometer | Evolution 201, Thermo Scientific, Madison, WI, USA | 5A4T092004 | |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich | 57-92-1 | |
| Thiamine | Panreac AppliChem | 59-43-8 | |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T4049 | |
| Tryptic Soy Agar (TSA) | VWR Chemicals | ICNA091010617 | |
| Tryptic Soy Broth (TSB) | VWR Chemicals | 22091 | |
| Ultrapure water | Advantage A10 Milli-Q lab, Merck, Darmstadt, Germany | F5HA17360B | |
| Vacuum pump | Buchi, Switzerland | FIS05-402-103 | |
| Vitamin B12 | Merck | 68-19-9 |
Riferimenti
- Charoensiddhi, S., Abraham, R. E., Su, P., Zhang, W. Seaweed and seaweed-derived metabolites as prebiotics. Advances in Food and Nutrition Research. 91, 97-156 (2020).
- Roohinejad, S., Koubaa, M., Barba, F. J., Saljoughian, S., Amid, M., Greiner, R. Application of seaweeds to develop new food products with enhanced shelf-life, quality, and health-related beneficial properties. Food Research International. 99, 1066-1083 (2017).
- Hurd, C. L., Harrison, P. J., Bischof, K., Lobban, C. S. . Seaweed Ecology and Physiology. (second). , (2014).
- Freitas, M. V., Mouga, T., Correia, A. P., Afonso, C., Baptista, T. New insights on the sporulation, germination, and nutritional profile of Gracilaria gracilis (Rhodophyta) grown under controlled conditions. Journal of Marine Science and Engineering. 9 (6), 562 (2021).
- Friedlander, M. Advances in cultivation of Gelidiales. Journal of Applied Phycology. 20 (5), 451-456 (2008).
- Matos, G. S., Pereira, S. G., Genisheva, Z. A., Gomes, A. M., Teixeira, J. A., Rocha, C. M. R. Advances in extraction methods to recover added-value compounds from seaweeds: Sustainability and functionality. Foods. 10, 516 (2021).
- Ummat, V., Sivagnanam, S. P., Rajauria, G., O’Donnell, C., Tiwari, B. K. Advances in pre-treatment techniques and green extraction technologies for bioactives from seaweeds. Trends in Food Science & Technology. 110, 90-106 (2021).
- Pérez, M. J., Falqué, E., Domínguez, H., Ravishankar, G., Ambati, R. R. Seaweed Antimicrobials, Present Status and Future Perspectives. Handbook of Algal Technologies andPhytochemicals:Volume I Food, Health and Nutraceutical Applications. , (2019).
- Cavallo, R. A., Acquaviva, M. I., Stabili, L., Cecere, E., Petrocelli, A., Narracci, M. Antibacterial activity of marine macroalgae against fish pathogenic Vibrio species. Central European Journal of Biology. 8, 646-653 (2013).
- Shannon, E., Abu-Ghannam, N. Antibacterial derivatives of marine algae: An overview of pharmacological mechanisms and applications. Marine Drugs. 14 (4), 81 (2016).
- Capillo, G., et al. New insights into the culture method and antibacterial potential of Gracilaria gracilis. Marine Drugs. 16 (12), 492 (2018).
- Francavilla, M., Franchi, M., Monteleone, M., Caroppo, C. The red seaweed Gracilaria gracilis as a multi products source. Marine Drugs. 11 (10), 3754-3776 (2013).
- Sánchez-Ayora, H., Pérez-Jiménez, J., Pérez-Correa, J. R., Mateos, R., Domínguez, R. Antioxidant Capacity of Seaweeds: In Vitro and In Vivo Assessment. Marine Phenolic Compounds. , 299-341 (2023).
- Anil, S., Sweety, V. K., Vikas, B., Betsy-Joseph, B. . Cytotoxicity and Cell Viability Assessment of Biomaterials. Cytotoxicity. , 111822 (2023).
- Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
- Roleda, M. Y., et al. Variations in polyphenol and heavy metal contents of wild-harvested and cultivated seaweed bulk biomass: Health risk assessment and implication for food applications. Food Control. 95, 121-134 (2019).
- Souza, K. D., et al. Gastronomy and the development of new food products: Technological prospection. International Journal of Gastronomy and Food Science. 33, 100769 (2023).
- Pereira, T., et al. Optimization of phycobiliprotein pigments extraction from red algae Gracilaria gracilis for substitution of synthetic food colorants. Food Chemistry. 321, 126688 (2020).
- Redmond, S., Green, L., Yarish, C., Kim, J., Neefus, C., Redmond, S., Green, L., Yarish, C., Kim, J., Neefus, C. . New England Seaweed Culture Handbook-Nursery Systems. , (2014).
- Yong, Y. S., Yong, W. T. L., Anton, A. Analysis of formulae for determination of seaweed growth rate. Journal of Applied Phycology. 25 (6), 1831-1834 (2013).
- Patarra, R. F., Carreiro, A. S., Lloveras, A. A., Abreu, M. H., Buschmann, A. H., Neto, A. I. Effects of light, temperature and stocking density on Halopteris scoparia growth. Journal of Applied Phycology. 29 (1), 405-411 (2017).
- NCCLS, National Committee for Clinical Laboratory Standards, Clinical and Laboratory Standards Institute. . Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests: Approved Standard. 32, M02-M11 (2012).
- Singleton, V. L., Rossi, J. A. J. Colorimetry to total phenolics with phosphomolybdic acid reagents. American Journal of Enology and Viticulture. 16, 144-158 (1965).
- Duan, X. J., Zhang, W. W., Li, X. M., Wang, B. G. Evaluation of antioxidant property of extract and fractions obtained from a red alga, Polysiphonia urceolata. Food Chemistry. 95 (1), 37-43 (2006).
- Freitas, R., et al. Highlighting the biological potential of the brown seaweed Fucus spiralis for skin applications. Antioxidants. 9 (7), 611 (2020).
- Duarte, A., et al. Seasonal study of the nutritional composition of unexploited and low commercial value fish species from the Portuguese coast. Food Science and Nutrition. 10 (10), 3368-3379 (2020).
- Folch, J., Lees, M., Stanley, G. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).
- ISO 6865. Animal feeding stuffs – Determination of crude fibre content – Method with intermediate filtration. Bureau of Indian Standards (BIS). , (2000).
- Fernández, A., Grienke, U., Soler-Vila, A., Guihéneuf, F., Stengel, D. B., Tasdemir, D. Seasonal and geographical variations in the biochemical composition of the blue mussel (Mytilus edulis L.) from Ireland. Food Chemistry. 177, 43-52 (2015).
- Pinto, F., et al. Annual variations in the mineral element content of five fish species from the Portuguese coast. Food Research International. 158, 111482 (2022).
- Food energy – methods of analysis and conversion factors. Available from: https://www.fao.org/fileadmin/templates/food_composition/documents/book_abstracts/Food_energy.pdf (2003)
- . 1169/2011 of the European Parliament and of the Council of 25 -10-2011 Available from: https://eur-lex.europa.eu/legal-content/EN/ALL/?uri=CELEX%3A32011R1169 (2011)
- Pathare, P. B., Opara, U. L., Al-Said, F. A. J. Colour measurement and analysis in fresh and processed foods: A review. Food and Bioprocess Technology. 6 (1), 36-60 (2013).
- ISO 4120. Sensory analysis – Methodology – Triangle test. International Standard. , (2004).
- Reller, L. B., Weinstein, M., Jorgensen, J. H., Ferraro, M. J. Antimicrobial susceptibility testing: A review of general principles and contemporary practices. Clinical Infectious Diseases. 49 (11), 1749-1755 (2009).
- Balouiri, M., Sadiki, M., Ibnsouda, S. K. Methods for in vitro evaluating antimicrobial activity: A review. Journal of Pharmaceutical Analysis. 6 (2), 71-79 (2016).
- Gajic, I., et al. Antimicrobial susceptibility testing: A comprehensive review of currently used methods. Antibiotics. 11 (4), 427 (2022).
- Gonzalez-Pastor, R., et al. Current landscape of methods to evaluate antimicrobial activity of natural extracts. Molecules. 28 (3), 1068 (2023).
- Li, J., et al. Antimicrobial activity and resistance: Influencing factors. Frontiers in Pharmacology. 13 (8), 364 (2017).
- Silva, A., et al. Macroalgae as a source of valuable antimicrobial compounds: Extraction and applications. Antibiotics. 9 (10), 642 (2020).
- Munteanu, I. G., Apetrei, C. Analytical methods used in determining antioxidant activity: A review. International Journal of Molecular Sciences. 22 (7), 3380 (2021).
- Ma, S., et al. Comparison of common analytical methods for the quantification of total polyphenols and flavanols in fruit juices and ciders. Journal of Food Science. 84 (8), 2147-2158 (2019).
- Tziveleka, L. A., Tammam, M. A., Tzakou, O., Roussis, V., Ioannou, E. Metabolites with antioxidant activity from marine macroalgae. Antioxidants. 10 (9), 1431 (2021).
- Ghasemi, M., Turnbull, T., Sebastian, S., Kempson, I. The MTT assay: Utility, limitations, pitfalls, and interpretation in bulk and single-cell analysis. International Journal of Molecular Sciences. 22 (23), 12827 (2021).
- Pereira, T., Barroso, S., Mendes, S., Gil, M. M. Stability, kinetics, and application study of phycobiliprotein pigments extracted from red algae Gracilaria gracilis. Journal of Food Science. 85 (10), 3400-3405 (2020).
