Følgende protokol præsenterer påvisning af enkeltstrengede DNA-foci i G1-fasen af cellecyklussen ved hjælp af cellecyklussynkronisering efterfulgt af RPA2-immunofluorescerende farvning.
DNA har dedikerede cellulære reparationsveje, der er i stand til at klare læsioner, der kan opstå fra både endogene og / eller eksogene kilder. DNA-reparation kræver samarbejde mellem adskillige proteiner, der er ansvarlige for at dække en bred vifte af opgaver fra at genkende og signalere tilstedeværelsen af en DNA-læsion til fysisk reparation af den. Under denne proces oprettes ofte spor af enkeltstrenget DNA (ssDNA), som til sidst fyldes af DNA-polymeraser. Arten af disse ssDNA-spor (med hensyn til både længde og antal) sammen med polymerasen rekrutteret til at udfylde disse huller er reparationsvejsspecifikke. Visualiseringen af disse ssDNA-spor kan hjælpe os med at forstå den komplicerede dynamik i DNA-reparationsmekanismer.
Denne protokol giver en detaljeret metode til fremstilling af G1-synkroniserede celler til måling af ssDNA-focidannelse ved genotoksisk stress. Ved hjælp af en brugervenlig immunfluorescenstilgang visualiserer vi ssDNA ved farvning for RPA2, en komponent i det heterotrimeriske replikationsprotein A-kompleks (RPA). RPA2 binder sig til og stabiliserer ssDNA-mellemprodukter, der opstår ved genotoksisk stress eller replikation for at kontrollere DNA-reparation og aktivering af DNA-skadekontrolpunkt. 5-ethynyl-2′-deoxyuridin (EdU) farvning bruges til at visualisere DNA-replikation for at udelukke eventuelle S-faseceller. Denne protokol giver en alternativ tilgang til de konventionelle, ikke-denaturerende 5-brom-2′-deoxyuridin (BrdU)-baserede assays og er bedre egnet til påvisning af ssDNA-foci uden for S-fasen.
For at opretholde livet overvåger og reparerer celler konstant DNA for at opretholde deres genomiske integritet. Celler kan akkumulere forskellige typer DNA-skader på grund af både endogene (f.eks. oxidation, alkylering, deaminering, replikationsfejl) og eksogene (f.eks. UV, ioniserende bestråling) kilder til DNA-stressorer. Manglende reparation af disse læsioner resulterer i enten apoptose, cellecyklusstop eller ældning og kan føre til sygdomme1. DNA-læsioner kan behandles ved hjælp af en af følgende primære DNA-reparationsveje: DR (direkte reverseringsreparation), som hovedsageligt reparerer alkylerede baser2; BER (base excision repair), som er rettet mod ikke-voluminøse DNA-basefejl og enkeltstrengede DNA-brud (SSB’er)3; NER (nukleotidexcisionsreparation) korrigering af voluminøse, helixforvrængende DNA-læsioner4; MMR (reparation af mismatch), der hovedsagelig er rettet mod DNA-mismatch, insertion/deletion loops (IDL’er) og visse baseskader5 NHEJ (ikke-homolog endesammenføjning) og HRR (homolog rekombinationsreparation), der begge er aktive ved dobbeltstrengede DNA-brud (DSB’er)6; og TLS (translesionssyntese), som er en DNA-læsionsbypassmekanisme7. Selvom disse veje har forskellige substratspecificiteter, er der visse overlapninger mellem dem for at sikre redundans for effektiv reparation. Forståelse af virkningen af de forskellige DNA-reparationsveje i forskellige cellecyklusfaser er afgørende, da disse DNA-reparationsfaktorer kan tjene som væsentlige mål for terapeutiske tilgange til behandling af kræft, aldring og neurologiske lidelser 8,9.
Enkeltstrenget DNA (ssDNA) genereres gennem hele cellecyklussen på grund af reparation af DNA-læsioner genereret af både endogene og eksogene DNA-skadelige stoffer. Ved genotoksisk stress genereres ssDNA rigeligt i S- og G2-faserne, hvor HRR og MFR har deres højeste aktivitet, og når replikationsmaskineriet går i stå eller kollapser, når de støder på DNA-læsioner 6,10,11. Andre DNA-reparationsveje (f.eks. NHEJ/mikrohomologi-medieret endesammenføjning (MMEJ)/enkeltstrenget udglødning [SSA]) genererer også ssDNA under DSB-reparation12. Disse ssDNA-spor opstår normalt fra DNA-resektion, udført af eksonukleaser såsom EXO1, DNA2 og CtIP under HR og MMR, endonukleaser såsom XPF og XPG under NER eller gennem den kombinerede virkning af POLB og FEN1 under BER 4,13,14,15,16,17,18,19 . På grund af replikationsmaskineriets arbejde genereres der også ssDNA-spor, når DNA-helicasene afvikler DNA foran de PCNA-bundne replikative polymeraser20. I modsætning hertil reducerer manglen på HRR- og DNA-replikation og den begrænsede aktivitet af MFR i G1-fasen omfanget af genererede ssDNA-spor og er derfor mere udfordrende at detektere 10,11,21.
Cellulære ssDNA-spor er meget følsomme strukturer, der skal beskyttes for at undgå dannelse af DSB’er. Dette opnås ved at belægge ssDNA-sporene med RPA. RPA er et rigeligt heterotrimerisk proteinkompleks sammensat af flere underenheder (RPA1, RPA2 og RPA3, også kaldet henholdsvis RPA70, RPA32 og RPA14), som udtrykkes allestedsnærværende gennem hele cellecyklussen22. Hver RPA-underenhed indeholder et DNA-bindende domæne (DBD), der er i stand til at interagere med 4-6 nukleotider, og de kombinerede underenheder danner en stabil trimeriseringskerne. I alt binder RPA til ca. 20-30 nukleotider med sub-nanomolær affinitet 23,24.
Konventionelle metoder bruger immunofluorescens (IF) mikroskopi til at visualisere ssDNA-foci ved mærkning af 5-brom-2′-deoxyuridin (BrdU) inkorporeret i genomisk DNA ved hjælp af BrdU-antistoffer25. Denne tilgang er afhængig af det faktum, at BrdU-antistoffer kun kan detektere BrdU i eksponeret ssDNA25. Selvom denne tilgang er ligetil, viser den også visse begrænsninger. For eksempel forbehandles celler for at inkorporere BrdU inden eksperimentets start, hvilket er tidskrævende og kan forstyrre nedstrøms effektorer. Derfor er BrdU-baseret ssDNA-detektion begrænset til replikerende celler og kan ikke bruges til hvilende celler. Dette udelukker anvendelsen af denne metode til at studere DNA-reparation i ikke-replikerende celler på trods af dens betydning i flere sygdomme såsom kræft og neurodegeneration 5,26. Derudover, fordi strukturerne i BrdU og EdU er meget ens, viser de fleste BrdU-antistoffer krydsreaktivitet over for EdU, hvilket skal overvejes, når man sigter mod dobbeltmærkningseksperimenter27. RPA-farvning er tidligere blevet brugt til at vise ssDNA-foci hovedsageligt i S-faseceller; nogle papirer har dog også med succes brugt det uden for S-fasen 28,29,30,31,32,33,34,35. Følgende protokol udnytter effektivt RPA’s egenskaber, hvilket muliggør visualisering af ssDNA-foci efter DNA-skade i G1-fasen af cellecyklussen (selvom den kan bruges i alle cellecyklusfaser).
Opretholdelse af en sund, mycoplasmafri cellekultur er afgørende for alle de ovenfor beskrevne eksperimenter. RPE1-celler har en stærk binding til vævskulturbehandlet plastvarer under normale dyrkningsmedier; Imidlertid mindskes deres bindingsegenskaber betydeligt, når de opbevares under serumfrie forhold. For at tage billeder i høj opløsning af ssDNA-foci under et mikroskop skal cellerne desuden belægges på et 0,17 mm tykt dækglas, som ikke er hydrofilt nok til at understøtte korrekt fastgørelse af RPE1-celler. Uden korrekt fladtrykte og jævnt fordelte celler er det meget udfordrende at visualisere individuelle ssDNA-foci. Derfor er det afgørende at vælge det rigtige belægningsmateriale (f.eks. vitronectin) og efterlade tilstrækkelig tid (6-12 timer) for cellerne at sprede sig og vedhæfte efter frigivelse af dem i G1-fase.
En udfordrende del af protokollen er at opnå homogene G1-synkroniserede RPE1-celler. Dette kræver to kritiske trin. For det første skal cellerne trypsiniseres, vaskes grundigt med PBS og direkte podes på nye vævskulturskåle ved hjælp af serumfrie medier for effektiv serumsult. Vask af cellerne direkte i vævskulturskåle for at fjerne serumet giver ikke effektiv G0-synkronisering. For det andet, når cellerne frigives i G1-fase, skal cellerne trypsiniseres igen og podes på friske vævskulturplader. På samme måde vil bare ændring af mediet og tilføjelse af serumholdigt dyrkningsmedium til cellerne ikke resultere i en synkron G1-post. For korrekt G1-indgang skal såtætheden af cellerne på de belagte dækglas desuden være på visse sammenløbsniveauer. Mens perfekt cellesynkronisering generelt er uopnåelig, giver denne synkroniseringsprotokol beskrevet her en ~ 97% ren G1-befolkning. Den anbefalede såtæthed for RPE1 på en dæksel med en diameter på 12 mm er ~4 × 104 for at opnå et homogent synsfelt til billeddannelse med ca. 70% sammenløb. Højere såtæthed får celler til at løsne sig og “skrælle af” efter CSK-ekstraktion og vil resultere i et højere baggrundssignal under billedoptagelse.
For at reducere ethvert baggrundssignal og opnå et gunstigt signal-støj-forhold er grundig vask efter primær og sekundær antistofinkubation afgørende. Da der skal anvendes mange vasketrin, er det også vigtigt at forhindre, at brønden tørrer ud under hvert vasketrin. Vi minimerer denne artefakt ved at anvende mindst 0,05% Triton X-100 i alle vaske- og inkubationstrin. Når brøndene tørrede ud, viste cellerne et ændret signal-støj-forhold; Dette fører til et mosaiklignende mønster under mikroskopet og kan forstyrre evalueringen. Z-stack-billedoptagelse kombineret med dekonvolution kan hjælpe med at fange foci i forskellige fokusplaner for at forbedre analysen.
Konventionelle metoder er afhængige af påvisning af inkorporeret BrdU under ikke-denaturerende forhold. Disse metoder afhænger imidlertid af forbehandling af cellerne med høje doser af BrdU i mindst 1-2 dage (eller tid svarende til en fuld cellecyklus i den anvendte cellelinje) for at sikre ensartet genomisk inkorporering. Uønsket kan omfattende BrdU-inkorporering forårsage cellecyklusinterferens36. For at løse disse begrænsninger bruger denne metode endogen RPA2 til at detektere ssDNA-foci. Denne tilgang kræver ikke replikationsdrevet BrdU-inkorporering, den kan også bruges i postmitotiske celler. Da omfattende BrdU-inkorporering ikke er nødvendig, sparer dette tid og reducerer eksperimentel kompleksitet. Ved at bruge RPA2-farvning til at visualisere ssDNA kan vi bruge 2′-deoxy-5-ethynyluridin (EdU) og klikkemi til at markere DNA-replikation og samtidig undgå mulig krydsreaktivitet af BrdU-antistofferne mod EdU 27,37,38. Der skal udvises særlig omhu for korrekt maskering af den inkorporerede EdU under klikreaktionen, så BrdU-antistofferne ikke krydsreagerer med EdU27,39.
Endelig er en vigtig fordel ved at bruge RPA2 i stedet for BrdU simpelthen at have et overlegent signal-støj-forhold sammenlignet med BrdU-farvning uden for S-fasen. Vi fandt ud af, at den ikke-denaturerende BrdU-farvning og dens evne til at visualisere ssDNA er begrænset til S-fase, selv i replikerende celler (figur 2). BrdU-antistof binder kun til det tilstrækkeligt eksponerede BrdU i ssDNA-strækninger. Bindingen af reparationsproteiner, herunder RPA2, til ssDNA-strækningerne kan undertrykke eller hæmme den tilstrækkelige eksponering af BrdU i ssDNA. Vi fandt også, at CSK-præekstraktion er nødvendig for ssDNA-visualisering ved hjælp af BrdU-antistof. Dette er muligt, fordi ssDNA-sporene ikke er tilgængelige for antistoffet uden at fjerne let bundne proteinkomponenter fra dem.
Ikke desto mindre er der nogle begrænsninger forbundet med denne protokol. En begrænsning ved at bruge RPA2 til ssDNA-detektion er behovet for at optimere CSK-præekstraktionstrinnet. Ubundet, overskydende RPA2 skal vaskes væk fra DNA’et, før cellerne fikseres. På den ene side fører underekstraktion til en høj baggrund på grund af RPA2-proteinfraktionen, der ikke er bundet til ssDNA. På den anden side vil overekstraktion føre til signaltab. For BrdU-detektion er dette ikke en variabel, da BrdU er stabilt inkorporeret i DNA’et og ikke kan vaskes væk ved præekstraktion. Derfor skal tidspunktet for CSK-præekstraktionen, mængden af Triton X-100 i bufferen, volumenet og temperaturen, ved hvilken forekstraktionen udføres, overvejes nøje. CSK præekstraktion begrænser også brugen af kernestørrelse til at skelne G0 / G1-celler fra S / G2-celler.
Derudover kan vi ikke udelukke muligheden for, at noget af det signal, der kommer fra RPA2, stammer fra, at det er bundet til andre kromatinbindende proteininteraktorer. Man skal også overveje artsspecificiteten af RPA2-antistoffet. Antistoffet, der anvendes i denne protokol, kan genkende RPA2 for mennesker, mus, rotter, hamster og aber. En anden begrænsning ved denne fremgangsmåde er, at ikke alle cellelinjer kan serumsultes til G0-synkronisering. De fleste kræftcellelinjer kan omgå cellecykluskontrolpunkter og sprede sig selv i serumberøvede medier. Selvom serumsult er gavnligt, da det ikke forårsager DNA-skade, skal man nøje overvåge deres cellesynkroniseringseffektivitet for at sikre, at korrekt cellecyklusfaseberigelse opnås. For celler, der ikke reagerer på serummangel, skal andre cellesynkroniseringsmetoder overvejes (f.eks. Mitotisk rystelse, CDK1-hæmning for G2-anholdelse eller ikke-invasive teknikker såsom centrifugalelutriering). En anden mulig metode er at bruge billeddannelse med højt indhold til at måle EdU- og nukleært DNA-indhold til cellecyklusprofilering af asynkrone celler31. Man skal overveje konsekvenserne af at bruge alternative synkroniseringsmetoder for at forhindre interferens med downstream-analyse. For eksempel vil brugen af dobbelt thymidinblok eller aphidicolin, der ofte anvendes i litteraturen, resultere i replikationsstress og DNA-skade40.
Undersøgelsen af DNA-reparationsmekanismer er fortsat et centralt diskussionspunkt inden for kræft og cellebiologi. Protokollen, der præsenteres her, tilbyder en værdifuld tilgang til fremstilling af celler, hvilket muliggør visualisering og kvantitativ analyse af ssDNA ved eksponering for DNA-skadelige stoffer. Især fremhæver denne protokol brugen af ssDNA-bindingsproteinet, RPA2, hvilket demonstrerer dets høje specificitet til at visualisere små mængder ssDNA-foci, samtidig med at uønsket krydsreaktivitet undgås i alle cellecyklusfaserne. Brug af RPA2 giver adskillige fordele, især for forskere, der sigter mod at analysere celler i G1-fasen af cellecyklussen. Denne protokol tager højde for flere begrænsninger og adresserer bekymringer relateret til signalinterferens, uønsket baggrundsstøj og krydsreaktivitet, når du bruger RPA2- eller BrdU-farvning til at detektere ssDNA.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker Michele Pagano for hans støtte og nyttige indsigt, Ashley Chui og Sharon Kaisari for kritisk at læse manuskriptet og Jeffrey Estrada og Vilma Diaz for deres fortsatte støtte. Dette arbejde blev støttet af et mangfoldighedstillæg til National Institutes of Health-tilskuddet GM136250.
Alpha-tubulin antibody | Sigma-Aldrich | T6074 | primary antibody (1:5,000) |
Axio Observer Inverted Microscope | Zeiss | na | microscope |
Bis-Tris Plus Mini Protein Gels, 4-12% | Invitrogen | NW04127BOX | Western Blot |
Bovine Serum Albumin | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | blocking |
BrdU (5-Bromo-2'-deoxyuridine) | Sigma-Aldrich | B5002-100MG | nucleotide analogue |
BrdU antibody BU1/75 | Abcam | ab6326 | primary antibody (1:500) |
CellAdhere Dilution Buffer | Stemcell Technologies | 07183 | coating reagent |
Click-iT Plus EdU Flow Cytometry Assay Kits | Invitrogen | C10632 | flow cytomery |
Click-iT Plus EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 647 dye | Thermo Fisher Scientific | C10640 | click-reaction kit |
cOmplete ULTRA Protease inhibitor tablets | Sigma-Aldrich | 5892791001 | reagent |
Countess 3 Automated cell counter | Thermo Scientific | AMQAX2000 | cell counter |
Coverslip | neuVitro | GG12PRE | tissue culture |
Cyclin A2 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-271682 | primary antibody (1:1,000) for IF and WB |
Cyclin B1 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-245 | primary antibody (1:5,000) |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650-100ML | vehicle control |
DMEM, high glucose, with HEPES | Gibco | 12430051 | cell culture medium for RPE cells |
DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190144 | the PBS used throughout the protocol |
D-Sucrose | Thermo Fisher Scientific | bp220-1 | reagent |
Eclipse Ti2 Series Epifluorescent Microscope | Nikon | na | microscope |
EdU (5-Ethynyl-2'-deoxyuridine) | Thermo Fisher Scientific | C10637 | nucleotide analog |
Falcon 24-well plate | Corning | 351147 | tissue culture |
Falcon Cell Culture Dishes 100 mm | Corning | 353003 | tissue culture |
Fetal Bovine Serum, heat inactivated | Gibco | 16140071 | media supplement |
Fiji (ImageJ) | NIH | version 1.54f | software and algorithms |
FxCycle PI/RNase Staining Solution | Invitrogen | F10797 | PI staining |
Goat anti-mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 555 | Thermo Fisher Scientific | A21422 | secondary antibody (1:1,000) |
Goat anti-rat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 | Thermo Fisher Scientific | A48262 | secondary antibody (1:1,000) |
Histone H3 antibody | Abcam | ab1791 | primary antibody (1:10,000) |
hTERT RPE1 | ATCC | CRL-3216 | cell line |
Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | H1758-100ML | reagent |
Hydrogen peroxide 30% soultion | Sigma-Aldrich | H1009-100ML | reagent |
Hydroxyurea,98% powder | Sigma-Aldrich | H8627-5G | reagent |
Invitrogen Ultra Pure 0.5 M EDTA pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | 15-575-020 | reagent |
Lipfectamine RNAiMAX Transfection Reagent | Invitrogen | 13778150 | transfection reagent |
Magnesium chloride solution 1 M | Sigma-Aldrich | M1028-100ML | reagent |
MycoFluor | Thermo Fisher | M7006 | Mycoplasma Detection Kit |
Neocarzinostatin from Streptomyces carzinostaticus | Sigma-Aldrich | N9162-100UG | reagent |
NuPage MES SDS Running Buffer (20x) | Invitrogen | NP0002 | Western Blot |
onTARGETplus Human RPA2 siRNA | Dharmacon | L-017058-01-0005 | siRNA |
p27 antibody | BD Biosciences | 610241 | primary antibody (1:1,000) |
Paraformaldehyde aqueous solution (32%) | Electron Microscopy Sciences | 50-980-494 | fixative |
PARP1 antibody | Cell Signaling Technology | 9542S | primary antibody (1:1,000) |
PCNA antibody | Cell Signaling Technology | 13110S | primary antibody (1:2,000) |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140163 | media supplement |
pH3 antibody | Cell Signaling Technology | 3377S | primary antibody (1:2,000) |
PhosSTOP phosphatase inhibitor tablets | Sigma-Aldrich | 4906837001 | reagent |
PIPES Buffer 0.5 M solution, pH 7.0 | Bioworld | 41620034-1 | reagent |
Precision Plus Protein Kaleidoscope Prestained Protein Standards | Bio-Rad | 1610395 | Western Blot |
Prism | GraphPad | version 10 | statistical analysis and graph |
ProLong Diamond Antifade Mountant | Thermo Scientific | P36961 | mounting media |
Reduced serum media (Opti-MEM) | Gibco | 31985070 | used for transfection |
Rpa32/rpa2 antibody (mouse) | EMD Millipore | NA19L | primary antibody (1:1,000) for WB |
Rpa32/rpa2 antibody (rat) | Cell Signaling Technology | 2208S | primary antibody (1:1,000) for IF |
Sodium Chloride solution (5 M) | Sigma-Aldrich | S5150 | reagent |
Sodium Pyruvate (100 mM) | Gibco | 11360070 | media supplement |
Sodium tetraborate decahydrate | Sigma-Aldrich | B3535-500G | reagent |
Thermo Scientific Pierce DAPI Nuclear Counterstain | Thermo Scientific | 62248 | nucleic acid stain |
Thymidine,powder | Sigma-Aldrich | T1985-1G | reagent |
Triton X-100 aqueous solution (10%) | Sigma-Aldrich | 11332481001 | detergent |
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red | Gibco | 1540054 | cell dissociation agent |
Vitronectin XF | Stemcell Technologies | 07180 | coating reagent |
ZE5 Cell Analyzer | Bio-Rad | na | flow cytomery |