निम्नलिखित प्रोटोकॉल सेल चक्र सिंक्रनाइज़ेशन का उपयोग सेल चक्र के G1 चरण में एकल असहाय डीएनए foci का पता लगाने RPA2 immunofluorescent धुंधला द्वारा पीछा प्रस्तुत करता है.
डीएनए में समर्पित सेलुलर मरम्मत मार्ग हैं जो घावों से मुकाबला करने में सक्षम हैं जो अंतर्जात और / या बहिर्जात स्रोतों दोनों से उत्पन्न हो सकते हैं। डीएनए की मरम्मत के लिए कई प्रोटीनों के बीच सहयोग की आवश्यकता होती है, जो डीएनए घाव की उपस्थिति को पहचानने और संकेत देने से लेकर शारीरिक रूप से मरम्मत करने तक कार्यों की एक विस्तृत श्रृंखला को कवर करने के लिए जिम्मेदार होते हैं। इस प्रक्रिया के दौरान, एकल-फंसे डीएनए (ssDNA) के ट्रैक अक्सर बनाए जाते हैं, जो अंततः डीएनए पोलीमरेज़ द्वारा भरे जाते हैं। इन एसएसडीएनए पटरियों की प्रकृति (लंबाई और संख्या दोनों के संदर्भ में), इन अंतरालों को भरने के लिए भर्ती किए गए पोलीमरेज़ के साथ, मरम्मत मार्ग-विशिष्ट हैं। इन ssDNA पटरियों के दृश्य हमें डीएनए की मरम्मत तंत्र की जटिल गतिशीलता को समझने में मदद कर सकते हैं.
यह प्रोटोकॉल जीनोटॉक्सिक तनाव पर ssDNA foci गठन को मापने के लिए G1 सिंक्रनाइज़ कोशिकाओं की तैयारी के लिए एक विस्तृत विधि प्रदान करता है। उपयोग में आसान इम्यूनोफ्लोरेसेंस दृष्टिकोण का उपयोग करते हुए, हम आरपीए 2 के लिए धुंधला करके एसएसडीएनए की कल्पना करते हैं, जो हेटरोट्रिमेरिक प्रतिकृति प्रोटीन ए कॉम्प्लेक्स (आरपीए) का एक घटक है। RPA2 ssDNA मध्यवर्ती को बांधता है और स्थिर करता है जो डीएनए की मरम्मत और डीएनए क्षति चेकपॉइंट सक्रियण को नियंत्रित करने के लिए जीनोटॉक्सिक तनाव या प्रतिकृति पर उत्पन्न होता है। 5-एथिनिल-2′-डीऑक्सीयूरिडाइन (ईडीयू) धुंधला किसी भी एस चरण कोशिकाओं को बाहर करने के लिए डीएनए प्रतिकृति की कल्पना करने के लिए प्रयोग किया जाता है। यह प्रोटोकॉल पारंपरिक, गैर-विकृतीकरण 5-ब्रोमो-2′-डीऑक्सीयूरिडीन (बीआरडीयू)-आधारित परख के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण प्रदान करता है और एस चरण के बाहर एसएसडीएनए फ़ॉसी का पता लगाने के लिए बेहतर अनुकूल है।
जीवन को बनाए रखने के लिए, कोशिकाएं अपनी जीनोमिक अखंडता को बनाए रखने के लिए डीएनए का लगातार सर्वेक्षण और मरम्मत करती हैं। डीएनए तनावों के अंतर्जात (जैसे, ऑक्सीकरण, क्षारीकरण, डीमिनेशन, प्रतिकृति त्रुटियों) और बहिर्जात (जैसे, यूवी, आयनकारी विकिरण) दोनों स्रोतों के कारण कोशिकाएं विभिन्न प्रकार के डीएनए क्षति जमा कर सकती हैं। इन घावों की मरम्मत में विफलता के परिणामस्वरूप या तो एपोप्टोसिस, सेल चक्र गिरफ्तारी, या बुढ़ापा होता है और बीमारियों का कारण बन सकताहै। डीएनए घावों को निम्नलिखित मुख्य डीएनए मरम्मत मार्गों में से किसी एक द्वारा संबोधित किया जा सकता है: डीआर (डायरेक्ट रिवर्सल रिपेयर), जो मुख्य रूप से अल्काइलेटेड बेस2 की मरम्मत करता है; बीईआर (बेस एक्सिशन रिपेयर), जो गैर-भारी डीएनए बेस त्रुटियों और एकल-फंसे डीएनए ब्रेक (एसएसबी) को लक्षित करता है3; एनईआर (न्यूक्लियोटाइड छांटना मरम्मत) भारी, हेलिक्स-विकृत डीएनए घावों को सही करना4; एमएमआर (बेमेल मरम्मत) मुख्य रूप से डीएनए बेमेल, सम्मिलन/विलोपन लूप (आईडीएल), और कुछ आधार क्षति को लक्षित करना5; NHEJ (नॉन-होमोलॉगस एंड जॉइनिंग) और HRR (होमोलॉगस रिकॉम्बिनेशन रिपेयर) जो दोनों डबल-स्ट्रैंडेड डीएनए ब्रेक (DSBs)6 पर सक्रिय हैं; और टीएलएस (अनुवाद संश्लेषण), जो एक डीएनए घाव बाईपास तंत्र7 है। हालांकि इन मार्गों में अलग-अलग सब्सट्रेट विशिष्टताएं हैं, लेकिन कुशल मरम्मत के लिए अतिरेक सुनिश्चित करने के लिए उनके बीच कुछ ओवरलैप हैं। विभिन्न सेल चक्र चरणों में विभिन्न डीएनए मरम्मत मार्गों की कार्रवाई को समझना महत्वपूर्ण है क्योंकि ये डीएनए मरम्मत कारक कैंसर, उम्र बढ़ने और तंत्रिका संबंधी विकारों के इलाज के लिए चिकित्सीय दृष्टिकोण के लिए आवश्यक लक्ष्यके रूप में काम कर सकते हैं।
अंतर्जात और बहिर्जात डीएनए-हानिकारक एजेंटों दोनों द्वारा उत्पन्न डीएनए घावों की मरम्मत के कारण पूरे सेल चक्र में एकल-फंसे डीएनए (एसएसडीएनए) उत्पन्न होते हैं। जीनोटॉक्सिक तनाव पर, एसएसडीएनए एस और जी 2 चरणों में बहुतायत से उत्पन्न होता है जहां एचआरआर और एमएमआर की उच्चतम गतिविधि होती है और जब प्रतिकृति मशीनरी स्टालों या ढह जाती है जब डीएनए घावों का सामना करना पड़ता है 6,10,11. अन्य डीएनए मरम्मत रास्ते (जैसे, एनएचईजे / माइक्रोहोमोलॉजी-मध्यस्थता अंत में शामिल होने (एमएमईजे / एकल स्ट्रैंड एनीलिंग [एसएसए]) भी डीएसबी मरम्मत12 के दौरान एसएसडीएनए उत्पन्न करते हैं। ये ssDNA ट्रैक आमतौर पर डीएनए लकीर से उत्पन्न होते हैं, जो HR और MMR के दौरान EXO1, DNA2, और CtIP जैसे एक्सोन्यूक्लिज़ द्वारा किए जाते हैं, NER के दौरान XPF और XPG जैसे एंडोन्यूक्लाइजेस, या BER 4,13,14,15,16,17,18,19 के दौरान POLB और FEN1 की संयुक्त कार्रवाई के माध्यम से . प्रतिकृति मशीनरी के काम के कारण, ssDNA ट्रैक भी उत्पन्न होते हैं जब डीएनए हेलिकेज़ PCNA-बाध्य प्रतिकृति पोलीमरेज़20 के सामने डीएनए को खोलते हैं। इसके विपरीत, जी 1 चरण में, एचआरआर और डीएनए प्रतिकृति की कमी और एमएमआर की सीमित गतिविधि उत्पन्न एसएसडीएनए पटरियों की सीमा को कम करती है और इसलिए10,11,21 का पता लगाने के लिए अधिक चुनौतीपूर्ण हैं।
सेलुलर ssDNA ट्रैक अत्यधिक संवेदनशील संरचनाएं हैं जिन्हें DSB के गठन से बचने के लिए संरक्षित किया जाना चाहिए। यह आरपीए के साथ ssDNA पटरियों को कोटिंग करके प्राप्त किया जाता है। RPA एक प्रचुर मात्रा में हेटेरोट्रिमेरिक प्रोटीन कॉम्प्लेक्स है जो कई सबयूनिट्स (RPA1, RPA2, और RPA3, जिसे क्रमशः RPA70, RPA32 और RPA14 भी कहा जाता है) से बना है, जो पूरे सेल चक्र22 में सर्वव्यापी रूप से व्यक्त किए जाते हैं। प्रत्येक RPA सबयूनिट में एक डीएनए-बाइंडिंग डोमेन (DBD) होता है, जो 4-6 न्यूक्लियोटाइड के साथ बातचीत करने में सक्षम होता है, और संयुक्त सबयूनिट्स एक स्थिर ट्रिमराइजेशन कोर बनाते हैं। कुल मिलाकर, आरपीए उप-नैनोमोलर आत्मीयता 23,24के साथ लगभग 20-30 न्यूक्लियोटाइड को बांधता है।
पारंपरिक तरीकों immunofluorescence (आईएफ) माइक्रोस्कोपी का उपयोग करने के लिए 5-bromo-2′-deoxyuridine (BrdU) BrdU एंटीबॉडी25 का उपयोग कर जीनोमिक डीएनए में शामिल लेबल द्वारा ssDNA foci कल्पना करने के लिए. यह दृष्टिकोण इस तथ्य पर निर्भर करता है कि BrdU एंटीबॉडी केवल उजागर ssDNA25 में BrdU का पता लगा सकते हैं। हालांकि यह दृष्टिकोण सीधा है, यह कुछ सीमाओं को भी प्रदर्शित करता है। उदाहरण के लिए, कोशिकाओं को प्रयोग की शुरुआत से पहले BrdU को शामिल करने के लिए पूर्वनिर्धारित किया जाता है, जो समय लेने वाली है और डाउनस्ट्रीम प्रभावकों के साथ हस्तक्षेप कर सकती है। इसलिए, BrdU- आधारित ssDNA डिटेक्शन कोशिकाओं की प्रतिकृति तक सीमित है और इसका उपयोग मौन कोशिकाओं के लिए नहीं किया जा सकता है। यह कैंसर और neurodegeneration 5,26 जैसे कई रोगों में अपने महत्व के बावजूद गैर प्रतिकृति कोशिकाओं में डीएनए की मरम्मत का अध्ययन करने के लिए इस पद्धति के आवेदन को बाहर करता है. इसके अतिरिक्त, क्योंकि BrdU और EdU की संरचनाएं बहुत समान हैं, अधिकांश BrdU एंटीबॉडी EdU की ओर क्रॉसरिएक्टिविटी प्रदर्शित करते हैं, जिसे दोहरी लेबलिंग प्रयोगों27 के लिए लक्ष्य करते समय विचार किया जाना चाहिए। RPA धुंधला पहले ssDNA foci मुख्य रूप से एस चरण कोशिकाओं में दिखाने के लिए इस्तेमाल किया गया है; हालाँकि, कुछ कागजात ने एस चरण 28,29,30,31,32,33,34,35 के बाहर भी इसका सफलतापूर्वक उपयोग किया है। निम्नलिखित प्रोटोकॉल कुशलता से आरपीए के गुणों का उपयोग करता है, जिससे कोशिका चक्र के जी 1 चरण में डीएनए क्षति के बाद एसएसडीएनए फॉसी के दृश्य की अनुमति मिलती है (हालांकि इसका उपयोग सभी सेल चक्र चरणों में किया जा सकता है)।
एक स्वस्थ, माइकोप्लाज्मा मुक्त सेल संस्कृति को बनाए रखना ऊपर वर्णित सभी प्रयोगों के लिए महत्वपूर्ण है। RPE1 कोशिकाओं में सामान्य संवर्धन मीडिया के तहत ऊतक संस्कृति-उपचारित प्लास्टिकवेयर के लिए एक मजबूत लगाव होता है; हालांकि, सीरम मुक्त परिस्थितियों में रखे जाने पर उनकी बाध्यकारी विशेषताएं काफी कम हो जाती हैं। इसके अतिरिक्त, एक माइक्रोस्कोप के तहत ssDNA foci की उच्च-रिज़ॉल्यूशन छवियों को कैप्चर करने के लिए, कोशिकाओं को 0.17 मिमी मोटी कवर ग्लास पर चढ़ाया जाना चाहिए, जो RPE1 कोशिकाओं के उचित लगाव का समर्थन करने के लिए पर्याप्त हाइड्रोफिलिक नहीं है। ठीक से चपटा और समान रूप से वितरित कोशिकाओं के बिना, व्यक्तिगत ssDNA foci की कल्पना करना बहुत चुनौतीपूर्ण है। इसलिए, उचित कोटिंग सामग्री (जैसे, विट्रोनेक्टिन) का चयन करना और कोशिकाओं को जी 1 चरण में जारी करने के बाद फैलाने और संलग्न करने के लिए पर्याप्त समय (6-12 घंटे) छोड़ना महत्वपूर्ण है।
प्रोटोकॉल का एक चुनौतीपूर्ण हिस्सा सजातीय G1 सिंक्रनाइज़ RPE1 कोशिकाओं को प्राप्त करना है। इसके लिए दो महत्वपूर्ण चरणों की आवश्यकता होती है। सबसे पहले, कुशल सीरम भुखमरी के लिए, कोशिकाओं को ट्रिप्सिनाइज्ड करने की आवश्यकता होती है, पीबीएस के साथ अच्छी तरह से धोया जाता है, और सीधे सीरम मुक्त मीडिया का उपयोग करके नए टिशू कल्चर व्यंजनों पर वरीयता प्राप्त होती है। सीरम को हटाने के लिए टिशू कल्चर व्यंजन में सीधे कोशिकाओं को धोने कुशल G0 तुल्यवृत्त उपज नहीं होगा. दूसरा, जब जी 1 चरण में कोशिकाओं को रिहा करते हैं, तो कोशिकाओं को फिर से ट्रिप्सिनाइज्ड किया जाना चाहिए और ताजा टिशू कल्चर प्लेटों पर वरीयता प्राप्त करनी चाहिए। इसी तरह, बस माध्यम को बदलने और कोशिकाओं के लिए सीरम युक्त संवर्धन माध्यम जोड़ने एक तुल्यकालिक जी 1 प्रविष्टि में परिणाम नहीं होगा. इसके अतिरिक्त, उचित जी 1 प्रविष्टि के लिए, लेपित कवर चश्मे पर कोशिकाओं के बोने घनत्व कुछ संगम स्तर पर होना चाहिए. जबकि सही सेल सिंक्रनाइज़ेशन आम तौर पर अप्राप्य है, यहां वर्णित यह सिंक्रनाइज़ेशन प्रोटोकॉल ~ 97% शुद्ध जी 1 आबादी देता है। एक 12 मिमी व्यास coverslip पर RPE1 के लिए सिफारिश की बोने घनत्व ~ 4 × 104 इमेजिंग के लिए देखने का एक सजातीय क्षेत्र प्राप्त करने के लिए, लगभग 70% संगम के साथ. उच्च बीजारोपण घनत्व सीएसके निष्कर्षण के बाद कोशिकाओं को अलग और “छील-बंद” का कारण बनता है और छवि अधिग्रहण के दौरान एक उच्च पृष्ठभूमि संकेत में परिणाम होगा.
किसी भी पृष्ठभूमि संकेत को कम करने और एक अनुकूल सिग्नल-टू-शोर अनुपात प्राप्त करने के लिए, प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी इनक्यूबेशन के बाद पूरी तरह से धोना आवश्यक है। चूंकि कई धोने के चरणों को लागू किया जाना है, इसलिए प्रत्येक धोने के चरण के दौरान कुएं को सूखने से रोकना भी आवश्यक है। हम सभी धुलाई और इनक्यूबेशन चरणों में न्यूनतम 0.05% ट्राइटन X-100 लागू करके इस आर्टिफैक्ट को कम करते हैं। एक बार कुओं सूख जाने के बाद, कोशिकाओं ने एक परिवर्तित सिग्नल-टू-शोर अनुपात प्रदर्शित किया; यह माइक्रोस्कोप के नीचे एक मोज़ेक जैसा पैटर्न की ओर जाता है और मूल्यांकन में हस्तक्षेप कर सकता है। डीकनवोल्यूशन के साथ संयुक्त जेड-स्टैक छवि अधिग्रहण विश्लेषण को बेहतर बनाने के लिए विभिन्न फोकल विमानों में foci को कैप्चर करने में सहायता कर सकता है।
पारंपरिक तरीके गैर-विकृतीकरण स्थितियों के तहत शामिल BrdU का पता लगाने पर निर्भर करते हैं। हालांकि, ये विधियां समान जीनोमिक निगमन सुनिश्चित करने के लिए कम से कम 1-2 दिनों (या सेल लाइन में एक पूर्ण सेल चक्र के बराबर समय) के लिए BrdU के उच्च खुराक के साथ कोशिकाओं के ढोंग पर निर्भर करती हैं। अवांछनीय रूप से, व्यापक BrdU निगमन सेल चक्र हस्तक्षेप36 का कारण बन सकता है। इन सीमाओं को संबोधित करने के लिए, यह विधि ssDNA foci का पता लगाने के लिए अंतर्जात RPA2 का उपयोग करती है। इस दृष्टिकोण को प्रतिकृति-संचालित BrdU निगमन की आवश्यकता नहीं है, इसका उपयोग पोस्ट-माइटोटिक कोशिकाओं में भी किया जा सकता है। चूंकि व्यापक BrdU निगमन की आवश्यकता नहीं है, इससे समय की बचत होती है और प्रयोगात्मक जटिलता कम हो जाती है। SSDNA की कल्पना करने के लिए RPA2 धुंधला का उपयोग करके, हम EdU 27,37,38 के खिलाफ BrdU एंटीबॉडी की संभावित क्रॉसरिएक्टिविटी से बचने के दौरान डीएनए प्रतिकृति को चिह्नित करने के लिए 2′-deoxy-5-ethynyluridine (EdU) और क्लिक-केमिस्ट्री का उपयोग कर सकते हैं। क्लिक-रिएक्शन के दौरान शामिल EdU को ठीक से मास्क करने के लिए विशेष देखभाल की जानी चाहिए ताकि BrdU एंटीबॉडी EdU27,39 के साथ क्रॉस-रिएक्ट न करें।
अंत में, BrdU के बजाय RPA2 का उपयोग करने का एक महत्वपूर्ण लाभ S चरण के बाहर BrdU धुंधला होने की तुलना में बस एक बेहतर सिग्नल-टू-शोर अनुपात है। हमने पाया कि गैर-विकृतीकरण BrdU धुंधला हो जाना और ssDNA की कल्पना करने की इसकी क्षमता कोशिकाओं की प्रतिकृति में भी एस चरण तक ही सीमित है (चित्र 2)। BrdU एंटीबॉडी केवल ssDNA स्ट्रेच में पर्याप्त रूप से उजागर BrdU से बांधती है। SSDNA स्ट्रेच के लिए RPA2 सहित मरम्मत प्रोटीन का बंधन ssDNA में BrdU के पर्याप्त जोखिम को दबा या बाधित कर सकता है। हमने यह भी पाया कि BrdU एंटीबॉडी का उपयोग करके ssDNA विज़ुअलाइज़ेशन के लिए CSK पूर्व-निष्कर्षण आवश्यक है। यह संभव है क्योंकि ssDNA पटरियों उनमें से हल्के बाध्य प्रोटीन घटकों को हटाने के बिना एंटीबॉडी के लिए सुलभ नहीं हैं.
बहरहाल, इस प्रोटोकॉल से जुड़ी कुछ सीमाएं हैं। ssDNA का पता लगाने के लिए RPA2 का उपयोग करने की एक सीमा CSK पूर्व-निष्कर्षण चरण को अनुकूलित करने की आवश्यकता है। अनबाउंड, अतिरिक्त RPA2 कोशिकाओं को ठीक करने से पहले डीएनए से दूर धोया जाना चाहिए. एक ओर, अंडरएक्सट्रैक्शन RPA2 प्रोटीन अंश के कारण एक उच्च पृष्ठभूमि की ओर जाता है जो ssDNA के लिए बाध्य नहीं है। दूसरी ओर, ओवरएक्सट्रैक्शन से सिग्नल लॉस हो जाएगा। BrdU का पता लगाने के लिए, यह एक चर नहीं है क्योंकि BrdU को डीएनए में स्थिर रूप से शामिल किया गया है और इसे पूर्व-निष्कर्षण द्वारा धोया नहीं जा सकता है। इसलिए, सीएसके पूर्व-निष्कर्षण का समय, बफर में ट्राइटन X-100 की मात्रा, मात्रा और तापमान जिस पर पूर्व-निष्कर्षण किया जाता है, उस पर सावधानीपूर्वक विचार किया जाना चाहिए। CSK पूर्व-निष्कर्षण S/G2 कोशिकाओं से G0/G1 कोशिकाओं को भेदभाव करने के लिए नाभिक आकार के उपयोग को भी सीमित करता है।
इसके अतिरिक्त, हम इस संभावना को बाहर नहीं कर सकते हैं कि RPA2 से आने वाले कुछ सिग्नल अन्य क्रोमैटिन-बाइंडिंग प्रोटीन इंटरएक्टर्स से बंधे होने से उत्पन्न होते हैं। RPA2 एंटीबॉडी की प्रजातियों की विशिष्टता पर भी विचार करना चाहिए। इस प्रोटोकॉल में प्रयुक्त एंटीबॉडी मानव, माउस, चूहा, हम्सटर और बंदर RPA2 को पहचान सकती है। इस दृष्टिकोण की एक और सीमा यह है कि सभी सेल लाइनों को G0 सिंक्रनाइज़ेशन के लिए सीरम-भूखा नहीं किया जा सकता है। अधिकांश कैंसर सेल लाइनें सेल चक्र चौकियों को बायपास कर सकती हैं और सीरम से वंचित मीडिया में भी फैल सकती हैं। हालांकि सीरम भुखमरी फायदेमंद है, क्योंकि यह डीएनए क्षति का कारण नहीं बनता है, किसी को यह सुनिश्चित करने के लिए अपने सेल सिंक्रनाइज़ेशन दक्षता की सावधानीपूर्वक निगरानी करनी चाहिए कि उचित सेल चक्र चरण संवर्धन प्राप्त किया गया है। कोशिकाओं है कि सीरम अभाव का जवाब नहीं है के लिए, अन्य सेल तुल्यक्रन तरीकों पर विचार किया जाना चाहिए (जैसे, माइटोटिक शेक बंद, G2 गिरफ्तारी के लिए CDK1 निषेध, या केन्द्रापसारक elutriation के रूप में गैर इनवेसिव तकनीकों). एक अन्य संभव विधि अतुल्यकालिक कोशिकाओं31 के सेल चक्र रूपरेखा के लिए EdU और परमाणु डीएनए सामग्री को मापने के लिए उच्च सामग्री इमेजिंग का उपयोग कर रहा है. डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के साथ हस्तक्षेप को रोकने के लिए वैकल्पिक सिंक्रनाइज़ेशन विधियों का उपयोग करने के निहितार्थ पर विचार करना चाहिए। उदाहरण के लिए, डबल थाइमिडीन ब्लॉक या एफिडिकोलिन का उपयोग, अक्सर साहित्य में उपयोग किया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप प्रतिकृति तनाव और डीएनए क्षति40 होगी।
डीएनए की मरम्मत तंत्र की जांच कैंसर और कोशिका जीव विज्ञान के क्षेत्र में चर्चा का केंद्र बिंदु बनी हुई है। यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल कोशिकाओं की तैयारी के लिए एक मूल्यवान दृष्टिकोण प्रदान करता है, डीएनए को नुकसान पहुंचाने वाले एजेंटों के संपर्क में ssDNA के दृश्य और मात्रात्मक विश्लेषण को सक्षम करता है। विशेष रूप से, यह प्रोटोकॉल ssDNA बाध्यकारी प्रोटीन, RPA2 के उपयोग पर प्रकाश डालता है, जो सभी सेल चक्र चरणों में अवांछित क्रॉस-रिएक्टिविटी से बचने के दौरान ssDNA foci की छोटी मात्रा की कल्पना करने के लिए अपनी उच्च विशिष्टता का प्रदर्शन करता है। RPA2 का उपयोग कई फायदे प्रदान करता है, विशेष रूप से शोधकर्ताओं के लिए सेल चक्र के G1 चरण में कोशिकाओं का विश्लेषण करने का लक्ष्य रखता है। यह प्रोटोकॉल कई सीमाओं पर विचार करता है और ssDNA का पता लगाने के लिए RPA2 या BrdU धुंधला का उपयोग करते समय सिग्नल हस्तक्षेप, अवांछित पृष्ठभूमि शोर और क्रॉस-रिएक्टिविटी से संबंधित चिंताओं को संबोधित करता है।
The authors have nothing to disclose.
लेखक मिशेल पगानो को उनके समर्थन और सहायक अंतर्दृष्टि के लिए, एशले चुई और शेरोन कैसारी को पांडुलिपि को गंभीर रूप से पढ़ने के लिए, और जेफरी एस्ट्राडा और विल्मा डियाज़ को उनके निरंतर समर्थन के लिए धन्यवाद देते हैं। इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान अनुदान GM136250 के लिए एक विविधता पूरक द्वारा समर्थित किया गया था।
Alpha-tubulin antibody | Sigma-Aldrich | T6074 | primary antibody (1:5,000) |
Axio Observer Inverted Microscope | Zeiss | na | microscope |
Bis-Tris Plus Mini Protein Gels, 4-12% | Invitrogen | NW04127BOX | Western Blot |
Bovine Serum Albumin | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | blocking |
BrdU (5-Bromo-2'-deoxyuridine) | Sigma-Aldrich | B5002-100MG | nucleotide analogue |
BrdU antibody BU1/75 | Abcam | ab6326 | primary antibody (1:500) |
CellAdhere Dilution Buffer | Stemcell Technologies | 07183 | coating reagent |
Click-iT Plus EdU Flow Cytometry Assay Kits | Invitrogen | C10632 | flow cytomery |
Click-iT Plus EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 647 dye | Thermo Fisher Scientific | C10640 | click-reaction kit |
cOmplete ULTRA Protease inhibitor tablets | Sigma-Aldrich | 5892791001 | reagent |
Countess 3 Automated cell counter | Thermo Scientific | AMQAX2000 | cell counter |
Coverslip | neuVitro | GG12PRE | tissue culture |
Cyclin A2 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-271682 | primary antibody (1:1,000) for IF and WB |
Cyclin B1 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-245 | primary antibody (1:5,000) |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650-100ML | vehicle control |
DMEM, high glucose, with HEPES | Gibco | 12430051 | cell culture medium for RPE cells |
DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190144 | the PBS used throughout the protocol |
D-Sucrose | Thermo Fisher Scientific | bp220-1 | reagent |
Eclipse Ti2 Series Epifluorescent Microscope | Nikon | na | microscope |
EdU (5-Ethynyl-2'-deoxyuridine) | Thermo Fisher Scientific | C10637 | nucleotide analog |
Falcon 24-well plate | Corning | 351147 | tissue culture |
Falcon Cell Culture Dishes 100 mm | Corning | 353003 | tissue culture |
Fetal Bovine Serum, heat inactivated | Gibco | 16140071 | media supplement |
Fiji (ImageJ) | NIH | version 1.54f | software and algorithms |
FxCycle PI/RNase Staining Solution | Invitrogen | F10797 | PI staining |
Goat anti-mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 555 | Thermo Fisher Scientific | A21422 | secondary antibody (1:1,000) |
Goat anti-rat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 | Thermo Fisher Scientific | A48262 | secondary antibody (1:1,000) |
Histone H3 antibody | Abcam | ab1791 | primary antibody (1:10,000) |
hTERT RPE1 | ATCC | CRL-3216 | cell line |
Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | H1758-100ML | reagent |
Hydrogen peroxide 30% soultion | Sigma-Aldrich | H1009-100ML | reagent |
Hydroxyurea,98% powder | Sigma-Aldrich | H8627-5G | reagent |
Invitrogen Ultra Pure 0.5 M EDTA pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | 15-575-020 | reagent |
Lipfectamine RNAiMAX Transfection Reagent | Invitrogen | 13778150 | transfection reagent |
Magnesium chloride solution 1 M | Sigma-Aldrich | M1028-100ML | reagent |
MycoFluor | Thermo Fisher | M7006 | Mycoplasma Detection Kit |
Neocarzinostatin from Streptomyces carzinostaticus | Sigma-Aldrich | N9162-100UG | reagent |
NuPage MES SDS Running Buffer (20x) | Invitrogen | NP0002 | Western Blot |
onTARGETplus Human RPA2 siRNA | Dharmacon | L-017058-01-0005 | siRNA |
p27 antibody | BD Biosciences | 610241 | primary antibody (1:1,000) |
Paraformaldehyde aqueous solution (32%) | Electron Microscopy Sciences | 50-980-494 | fixative |
PARP1 antibody | Cell Signaling Technology | 9542S | primary antibody (1:1,000) |
PCNA antibody | Cell Signaling Technology | 13110S | primary antibody (1:2,000) |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140163 | media supplement |
pH3 antibody | Cell Signaling Technology | 3377S | primary antibody (1:2,000) |
PhosSTOP phosphatase inhibitor tablets | Sigma-Aldrich | 4906837001 | reagent |
PIPES Buffer 0.5 M solution, pH 7.0 | Bioworld | 41620034-1 | reagent |
Precision Plus Protein Kaleidoscope Prestained Protein Standards | Bio-Rad | 1610395 | Western Blot |
Prism | GraphPad | version 10 | statistical analysis and graph |
ProLong Diamond Antifade Mountant | Thermo Scientific | P36961 | mounting media |
Reduced serum media (Opti-MEM) | Gibco | 31985070 | used for transfection |
Rpa32/rpa2 antibody (mouse) | EMD Millipore | NA19L | primary antibody (1:1,000) for WB |
Rpa32/rpa2 antibody (rat) | Cell Signaling Technology | 2208S | primary antibody (1:1,000) for IF |
Sodium Chloride solution (5 M) | Sigma-Aldrich | S5150 | reagent |
Sodium Pyruvate (100 mM) | Gibco | 11360070 | media supplement |
Sodium tetraborate decahydrate | Sigma-Aldrich | B3535-500G | reagent |
Thermo Scientific Pierce DAPI Nuclear Counterstain | Thermo Scientific | 62248 | nucleic acid stain |
Thymidine,powder | Sigma-Aldrich | T1985-1G | reagent |
Triton X-100 aqueous solution (10%) | Sigma-Aldrich | 11332481001 | detergent |
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red | Gibco | 1540054 | cell dissociation agent |
Vitronectin XF | Stemcell Technologies | 07180 | coating reagent |
ZE5 Cell Analyzer | Bio-Rad | na | flow cytomery |