Triagem Transcriptomic-Based Drug Screening Custo-Eficiente
Summary
Este protocolo descreve um fluxo de trabalho de culturas de células ex vivo ou in vitro para pré-processamento de dados transcriptômicos para triagem de drogas baseada em transcriptoma custo-efetivo.
Abstract
A transcriptômica permite obter informações abrangentes sobre programas celulares e suas respostas a perturbações. Apesar da diminuição significativa dos custos de produção e sequenciamento das bibliotecas na última década, a aplicação dessas tecnologias na escala necessária para a triagem de drogas continua sendo proibitivamente cara, obstruindo o imenso potencial desses métodos. Nosso estudo apresenta um sistema custo-efetivo para triagem de drogas baseada em transcriptomas, combinando culturas de perturbação miniaturizadas com transcriptômica mini-massil. O protocolo otimizado de mini-bulk fornece sinais biológicos informativos em profundidade de sequenciamento econômica, permitindo uma extensa triagem de drogas conhecidas e novas moléculas. Dependendo do tratamento escolhido e do tempo de incubação, este protocolo resultará em bibliotecas de sequenciamento dentro de aproximadamente 2 dias. Devido a vários pontos de parada dentro deste protocolo, a preparação da biblioteca, bem como o sequenciamento, pode ser realizado de forma independente do tempo. É possível processar simultaneamente um número elevado de amostras; A medição de até 384 amostras foi testada sem perda da qualidade dos dados. Também não há limitações conhecidas para o número de condições e/ou drogas, apesar de considerar a variabilidade nos tempos ideais de incubação dos fármacos.
Introduction
O desenvolvimento de novos fármacos é um processo complexo e demorado que envolve a identificação de potenciais fármacos e seus alvos, a otimização e síntese de candidatos a fármacos e o teste de sua eficácia e segurança em ensaios pré-clínicos e clínicos1. Os métodos tradicionais de triagem de drogas, ou seja, a avaliação sistemática de bibliotecas de compostos candidatos para fins terapêuticos, envolvem o uso de modelos animais ou ensaios baseados em células para testar os efeitos em alvos ou vias específicas. Embora esses métodos tenham sido bem-sucedidos na identificação de candidatos a drogas, eles muitas vezes não forneceram informações suficientes sobre os complexos mecanismos moleculares subjacentes à eficácia da droga e também toxicidade e mecanismos de efeitos colaterais potenciais.
A avaliação de estados transcricionais genômicos apresenta uma abordagem poderosa para superar as limitações atuais na triagem de drogas, pois permite avaliações abrangentes da expressão gênica em resposta a tratamentos medicamentosos2. Ao medir transcritos de RNA de uma forma genômica ampla expressa em um determinado momento, a transcriptômica visa fornecer uma visão holística das mudanças transcricionais que ocorrem em resposta a drogas, incluindo mudanças nos padrões de expressão gênica, splicing alternativo e expressão de RNA não codificante3. Essas informações podem ser usadas para determinar alvos de drogas, prever eficácia e toxicidade de drogas e otimizar esquemas de dosagem e tratamento de medicamentos.
Um dos principais benefícios da combinação de transcriptômica com triagem imparcial de drogas é o potencial para identificar novos alvos de drogas que não foram considerados anteriormente. As abordagens convencionais de triagem de drogas geralmente se concentram em moléculas ou vias alvo estabelecidas, dificultando a identificação de novos alvos e potencialmente resultando em drogas com efeitos colaterais imprevistos e eficácia restrita. A transcriptômica pode superar essas limitações, fornecendo informações sobre as mudanças moleculares que ocorrem em resposta ao tratamento medicamentoso, descobrindo potenciais alvos ou vias que podem não ter sido consideradas anteriormente2.
Além da identificação de novos alvos de fármacos, a transcriptômica também pode ser utilizada para predizer eficácia e toxicidade de fármacos. Ao analisar os padrões de expressão gênica associados às respostas a drogas, biomarcadores podem ser desenvolvidos para prever a resposta de um paciente a um determinado medicamento ou regime de tratamento. Isso também pode ajudar a otimizar a dosagem de medicamentos e reduzir o risco de efeitos adversos4.
Apesar de seus potenciais benefícios, o custo da transcriptômica permanece uma barreira significativa para sua ampla aplicação na triagem de drogas. A análise transcriptômica requer equipamentos especializados, conhecimento técnico e análise de dados, o que pode tornar desafiador para equipes de pesquisa menores ou organizações com financiamento limitado utilizar transcriptômica na triagem de drogas. No entanto, o custo da transcriptômica tem diminuído constantemente, tornando-a mais acessível às comunidades de pesquisa. Além disso, os avanços na tecnologia e nos métodos de análise de dados tornaram a transcriptômica mais eficiente e econômica, aumentando ainda mais sua acessibilidade2.
Neste protocolo, descrevemos um sistema exploratório e de alta dimensão para triagem de drogas baseado em transcriptomas, combinando culturas de perturbação miniaturizadas com análise transcriptômica mini-bulk 5,6. Com este protocolo, é possível reduzir o custo por amostra para 1/6 do custo atual de soluções comerciais para sequenciamento total de mRNA. O protocolo requer apenas equipamentos laboratoriais padrão, sendo a única exceção o uso de tecnologias de sequenciamento de leitura curta, que podem ser terceirizadas se os instrumentos de sequenciamento não estiverem disponíveis internamente. O protocolo otimizado de mini-bulk fornece sinais biológicos ricos em informações em profundidade de sequenciamento econômica, permitindo uma extensa triagem de drogas conhecidas e novas moléculas.
O objetivo do experimento é rastrear a atividade de drogas em PBMCs em diferentes contextos biológicos. Este protocolo pode ser aplicado a qualquer questão biológica onde várias drogas devem ser testadas com uma leitura transcriptômica, dando uma visão ampla do transcriptoma do efeito celular do tratamento.
Protocol
Representative Results
Discussion
A descoberta de drogas e o desenvolvimento de drogas podem se beneficiar muito da visão holística dos processos celulares que a transcriptômica em massa pode fornecer. No entanto, essa abordagem é frequentemente limitada pelo alto custo do experimento com o protocolo RNA-seq a granel padrão, proibindo sua aplicação em ambientes acadêmicos, bem como seu potencial para escalabilidade industrial.
As etapas mais críticas do protocolo são o descongelamento celular e as etapas iniciais da …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
A J.L.S. é apoiada pela Fundação Alemã de Pesquisa (DFG) no âmbito da Estratégia de Excelência da Alemanha (EXC2151-390873048), bem como sob o SCHU 950/8-1; GRK 2168, TP11; CRC SFB 1454 Metaflammation, IRTG GRK 2168, WGGC INST 216/981-1, CCU INST 217/988-1, o projeto de excelência financiado pelo BMBF Diet-Body-Brain (DietBB); e o projeto da UE SYSCID sob o número de subvenção 733100. M.B. é suportado pela DFG (IRTG2168-272482170, SFB1454-432325352). A L.B. é apoiada pela DFG (ImmuDiet BO 6228/2-1 – Projeto número 513977171) e pela Estratégia de Excelência da Alemanha (EXC2151-390873048). Imagens criadas com BioRender.com.
Materials
| 50 mL conical tube | fisher scientific | 10203001 | |
| Adhesive PCR Plate Seals | Thermo Fisher Scientific | AB0558 | |
| Amplicon Tagment Mix (ATM) | Illumina | FC-131-1096 | Nextera XT DNA Library Prep Kit (96 samples) |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A 63881 | |
| Betaine | Sigma-Aldrich | 61962 | |
| Cell culture grade 96-well plates | Thermo Fisher Scientific | 260860 | |
| Cell culture vacuum pump (VACUSAFE) | Integra Bioscience | 158300 | |
| Deoxynucleotide triphosphates (dNTPs) mix 10 mM each | Fermentas | R0192 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 276855 | |
| DTT (100 mM) | Invitrogen | 18064-014 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 798681 | for adherent cells |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 51976 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | |
| Filter tips (10 µL) | Gilson | F171203 | |
| Filter tips (100 µL) | Gilson | F171403 | |
| Filter tips (20 µL) | Gilson | F171303 | |
| Filter tips (200 µL) | Gilson | F171503 | |
| Guanidine Hydrochloride | Sigma-Aldrich | G3272 | |
| ISPCR primer (10 µM) | Biomers.net GmbH | SP10006 | 5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG T-3′ |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X) | KAPA Biosystems | KK2601 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Magnetic stand 96 | Ambion | AM10027 | |
| Neutralize Tagment (NT) Buffer | Illumina | FC-131-1096 | Nextera XT DNA Library Prep Kit (96 samples), alternatively 0.2 % SDS |
| Nextera-compatible indexing primer | Illumina | ||
| Nuclease-free water | Invitrogen | 10977049 | |
| PBS | Thermo Fisher Scientific | AM9624 | |
| PCR 96-well plates | Thermo Fisher Scientific | AB0600 | |
| PCR plate sealer | Thermo Fisher Scientific | HSF0031 | |
| Penicillin / Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15070063 | |
| Qubit 4 fluorometer | Invitrogen | 15723679 | |
| Recombinant RNase inhibitor (40 U/ul) | TAKARA | 2313A | |
| RPMI-1640 cell culture medium | Gibco | 61870036 | If not working with PBMCs, adjust to cell type |
| SMART dT30VN primer | Sigma-Aldrich | 5' Bio-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACT30VN-3 |
|
| Standard lab equipment | various | various | e.g. centrifuge, ice machine, ice bucket, distilled water, water bath |
| SuperScript II Reverse Transcriptase (SSRT II) | Thermo Fisher Scientific | 18064-014 | |
| SuperScript II Reverse Transcriptase (SSRT II) buffer (5x) | Thermo Fisher Scientific | 18064-014 | |
| Tagment DNA Buffer (TD) | Illumina | FC-131-1096 | Nextera XT DNA Library Prep Kit (96 samples) |
| TapeStation system 4200 | Agilent | G2991BA | |
| Thermocycler (S1000) | Bio-Rad | 1852148 | |
| TSO-LNA (100 uM) | Eurogentec | 5' Biotin AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACAT(G)(G){G |
|
| Vortex-Genie 2 Mixer | Sigma-Aldrich | Z258415 |
Riferimenti
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- Carraro, C., et al. Decoding mechanism of action and sensitivity to drug candidates from integrated transcriptome and chromatin state. ELife. 11, 78012 (2022).
- Picelli, S., et al. Smart-seq2 for sensitive full-length transcriptome profiling in single cells. Nat Methods. 10 (11), 1096-1098 (2013).
- Picelli, S., et al. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2. Nat Protoc. 9 (1), 171-181 (2014).
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- Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biol. 15 (12), 550 (2014).
- Frankish, A., et al. GENCODE reference annotation for the human and mouse genomes. Nucleic Acids Res. 47, D766-D773 (2019).
