Экономичный транскриптомный скрининг лекарственных препаратов
Summary
Этот протокол описывает рабочий процесс от культивирования клеток ex vivo или in vitro до предварительной обработки транскриптомных данных для экономически эффективного скрининга лекарств на основе транскриптома.
Abstract
Транскриптомика позволяет получить всестороннее представление о клеточных программах и их реакциях на возмущения. Несмотря на значительное снижение затрат на библиотечное производство и секвенирование в последнее десятилетие, применение этих технологий в масштабах, необходимых для скрининга лекарств, остается непомерно дорогим, что препятствует огромному потенциалу этих методов. В нашем исследовании представлена экономически эффективная система скрининга лекарственных средств на основе транскриптома, сочетающая миниатюрные культуры возмущений с мини-объемной транскриптомикой. Оптимизированный протокол mini-bulk обеспечивает информативные биологические сигналы на экономически эффективной глубине секвенирования, что позволяет проводить обширный скрининг известных лекарств и новых молекул. В зависимости от выбранного лечения и инкубационного времени, этот протокол приведет к секвенированию библиотек в течение примерно 2 дней. Благодаря наличию нескольких остановочных точек в рамках этого протокола, подготовка библиотеки, а также секвенирование могут выполняться независимо от времени. Возможна одновременная обработка большого количества образцов; Измерение до 384 образцов было проведено без потери качества данных. Также не существует известных ограничений по количеству состояний и/или препаратов, несмотря на вариабельность оптимальных сроков инкубации лекарств.
Introduction
Разработка новых лекарственных средств представляет собой сложный и трудоемкий процесс, который включает в себя идентификацию потенциальных лекарственных средств и их мишеней, оптимизацию и синтез лекарственных препаратов-кандидатов, а также проверку их эффективности и безопасности в доклинических иклинических испытаниях1. Традиционные методы скрининга лекарственных средств, т.е. систематическая оценка библиотек соединений-кандидатов для терапевтических целей, предполагают использование животных моделей или клеточных анализов для проверки воздействия на конкретные мишени или пути. Несмотря на то, что эти методы были успешны в выявлении лекарств-кандидатов, они часто не давали достаточного представления о сложных молекулярных механизмах, лежащих в основе эффективности лекарств, а также о токсичности и механизмах потенциальных побочных эффектов.
Оценка полногеномных транскрипционных состояний представляет собой мощный подход к преодолению существующих ограничений в скрининге лекарственных препаратов, поскольку она позволяет проводить всестороннюю оценку экспрессии генов в ответ на медикаментозное лечение. Измеряя транскриптомы РНК в масштабах всего генома, экспрессируемые в определенный момент времени, транскриптомика стремится обеспечить целостное представление о транскрипционных изменениях, которые происходят в ответ на лекарственные препараты, включая изменения в паттернах экспрессии генов, альтернативный сплайсинги экспрессию некодирующей РНК. Эта информация может быть использована для определения мишеней для лекарственных препаратов, прогнозирования эффективности и токсичности лекарственных средств, а также оптимизации дозирования и схем лечения.
Одним из ключевых преимуществ сочетания транскриптомики с объективным скринингом лекарственных препаратов является возможность выявления новых мишеней для лекарственных препаратов, которые ранее не рассматривались. Традиционные подходы к скринингу лекарственных средств часто фокусируются на установленных молекулах-мишенях или путях, что затрудняет идентификацию новых мишеней и потенциально приводит к появлению лекарств с непредвиденными побочными эффектами и ограниченной эффективностью. Транскриптомика может преодолеть эти ограничения, предоставляя представление о молекулярных изменениях, которые происходят в ответ на медикаментозное лечение, раскрывая потенциальные мишени или пути, которые, возможно, ранеене рассматривались.
В дополнение к идентификации новых мишеней для лекарств, транскриптомика также может быть использована для прогнозирования эффективности и токсичности лекарств. Анализируя паттерны экспрессии генов, связанные с реакцией на лекарственные препараты, можно разработать биомаркеры, которые можно использовать для прогнозирования реакции пациента на конкретное лекарство или схему лечения. Это также может помочь оптимизировать дозировку лекарств и снизить риск неблагоприятных побочных эффектов4.
Несмотря на потенциальные преимущества, стоимость транскриптомики остается существенным препятствием для ее широкого применения в скрининге лекарственных препаратов. Транскриптомный анализ требует специализированного оборудования, технических знаний и анализа данных, что может затруднить использование транскриптомики в скрининге лекарств для небольших исследовательских групп или организаций с ограниченным финансированием. Тем не менее, стоимость транскриптомики неуклонно снижается, что делает ее более доступной для исследовательских сообществ. Кроме того, достижения в области технологий и методов анализа данных сделали транскриптомику более эффективной и экономичной, что еще больше повысило ее доступность2.
В этом протоколе мы описываем многомерную и исследовательскую систему для скрининга лекарств на основе транскриптома, сочетающую миниатюрные культуры возмущений с мини-объемным транскриптомным анализом 5,6. С помощью этого протокола можно снизить стоимость одного образца до 1/6от текущей стоимости коммерческих растворов для полноразмерного секвенирования мРНК. Протокол требует только стандартного лабораторного оборудования, единственным исключением является использование технологий секвенирования с коротким считыванием, которые могут быть переданы на аутсорсинг, если инструменты для секвенирования отсутствуют в компании. Оптимизированный протокол mini-bulk обеспечивает информационно насыщенные биологические сигналы на экономически эффективной глубине секвенирования, что позволяет проводить обширный скрининг известных лекарств и новых молекул.
Целью эксперимента является скрининг активности лекарственных средств на КПМК в различных биологических контекстах. Этот протокол может быть применен к любому биологическому вопросу, где несколько препаратов должны быть протестированы с транскриптомным считыванием, что дает общее представление о клеточном эффекте лечения.
Protocol
Representative Results
Discussion
Открытие и разработка лекарств могут значительно выиграть от целостного взгляда на клеточные процессы, который может обеспечить массовая транскриптомика. Тем не менее, этот подход часто ограничен высокой стоимостью эксперимента со стандартным протоколом массового секвенирования РН…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
J.L.S. поддерживается Немецким научно-исследовательским обществом (DFG) в рамках Стратегии совершенствования Германии (EXC2151-390873048), а также в соответствии с SCHU 950/8-1; ГРК 2168, ТП11; CRC SFB 1454 Metaflammation, IRTG GRK 2168, WGGC INST 216/981-1, CCU INST 217/988-1, финансируемый BMBF проект передового опыта «Диета-Тело-Мозг» (DietBB); и проект ЕС SYSCID по гранту No 733100. М.Б. поддерживается DFG (IRTG2168-272482170, SFB1454-432325352). L.B. поддерживается DFG (ImmuDiet BO 6228/2-1 – номер проекта 513977171) и Стратегией превосходства Германии (EXC2151-390873048). Изображения, созданные с помощью BioRender.com.
Materials
| 50 mL conical tube | fisher scientific | 10203001 | |
| Adhesive PCR Plate Seals | Thermo Fisher Scientific | AB0558 | |
| Amplicon Tagment Mix (ATM) | Illumina | FC-131-1096 | Nextera XT DNA Library Prep Kit (96 samples) |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A 63881 | |
| Betaine | Sigma-Aldrich | 61962 | |
| Cell culture grade 96-well plates | Thermo Fisher Scientific | 260860 | |
| Cell culture vacuum pump (VACUSAFE) | Integra Bioscience | 158300 | |
| Deoxynucleotide triphosphates (dNTPs) mix 10 mM each | Fermentas | R0192 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 276855 | |
| DTT (100 mM) | Invitrogen | 18064-014 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 798681 | for adherent cells |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 51976 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | |
| Filter tips (10 µL) | Gilson | F171203 | |
| Filter tips (100 µL) | Gilson | F171403 | |
| Filter tips (20 µL) | Gilson | F171303 | |
| Filter tips (200 µL) | Gilson | F171503 | |
| Guanidine Hydrochloride | Sigma-Aldrich | G3272 | |
| ISPCR primer (10 µM) | Biomers.net GmbH | SP10006 | 5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG T-3′ |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X) | KAPA Biosystems | KK2601 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Magnetic stand 96 | Ambion | AM10027 | |
| Neutralize Tagment (NT) Buffer | Illumina | FC-131-1096 | Nextera XT DNA Library Prep Kit (96 samples), alternatively 0.2 % SDS |
| Nextera-compatible indexing primer | Illumina | ||
| Nuclease-free water | Invitrogen | 10977049 | |
| PBS | Thermo Fisher Scientific | AM9624 | |
| PCR 96-well plates | Thermo Fisher Scientific | AB0600 | |
| PCR plate sealer | Thermo Fisher Scientific | HSF0031 | |
| Penicillin / Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15070063 | |
| Qubit 4 fluorometer | Invitrogen | 15723679 | |
| Recombinant RNase inhibitor (40 U/ul) | TAKARA | 2313A | |
| RPMI-1640 cell culture medium | Gibco | 61870036 | If not working with PBMCs, adjust to cell type |
| SMART dT30VN primer | Sigma-Aldrich | 5' Bio-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACT30VN-3 |
|
| Standard lab equipment | various | various | e.g. centrifuge, ice machine, ice bucket, distilled water, water bath |
| SuperScript II Reverse Transcriptase (SSRT II) | Thermo Fisher Scientific | 18064-014 | |
| SuperScript II Reverse Transcriptase (SSRT II) buffer (5x) | Thermo Fisher Scientific | 18064-014 | |
| Tagment DNA Buffer (TD) | Illumina | FC-131-1096 | Nextera XT DNA Library Prep Kit (96 samples) |
| TapeStation system 4200 | Agilent | G2991BA | |
| Thermocycler (S1000) | Bio-Rad | 1852148 | |
| TSO-LNA (100 uM) | Eurogentec | 5' Biotin AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACAT(G)(G){G |
|
| Vortex-Genie 2 Mixer | Sigma-Aldrich | Z258415 |
Riferimenti
- Hughes, J. P., Rees, S., Kalindjian, S. B., Philpott, K. L. Principles of early drug discovery. Br J Pharmacol. 162 (6), 1239-1249 (2011).
- Yang, X., et al. High-throughput transcriptome profiling in drug and biomarker discovery. Front Genet. 11, 19 (2020).
- Bonaguro, L., et al. A guide to systems-level immunomics. Nat Immunol. 23 (10), 1412-1423 (2022).
- Carraro, C., et al. Decoding mechanism of action and sensitivity to drug candidates from integrated transcriptome and chromatin state. ELife. 11, 78012 (2022).
- Picelli, S., et al. Smart-seq2 for sensitive full-length transcriptome profiling in single cells. Nat Methods. 10 (11), 1096-1098 (2013).
- Picelli, S., et al. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2. Nat Protoc. 9 (1), 171-181 (2014).
- De Domenico, E., et al. Optimized workflow for single-cell transcriptomics on infectious diseases including COVID-19. STAR Protoc. 1 (3), 100233 (2020).
- Dobin, A., et al. ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).
- Patro, R., et al. Salmon provides fast and bias-aware quantification of transcript expression. Nat Methods. 14 (4), 417-419 (2017).
- Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biol. 15 (12), 550 (2014).
- Frankish, A., et al. GENCODE reference annotation for the human and mouse genomes. Nucleic Acids Res. 47, D766-D773 (2019).
