Summary
यहां, हम सक्रिय स्थान परिहार परीक्षण के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं, कृन्तकों के लिए डिज़ाइन किया गया एक हिप्पोकैम्पस-निर्भर स्थानिक सीखने प्रतिमान। प्रमुख मापदंडों को बदलने से उपचार से पहले और बाद में या समय के साथ जानवरों के पुन: परीक्षण की अनुमति मिलती है।
Abstract
कृन्तकों में हिप्पोकैम्पस-निर्भर स्थानिक सीखने का परीक्षण विभिन्न तरीकों का उपयोग करके किया गया है। इनमें मॉरिस वाटर भूलभुलैया (MWM), Y-भूलभुलैया और उपन्यास वस्तु स्थान (NOL) कार्य शामिल हैं। हाल ही में, सक्रिय स्थान से बचाव (एपीए) कार्य को इन पारंपरिक दृष्टिकोणों के विकल्प के रूप में विकसित किया गया है। एपीए कार्य में, चूहों को एक स्थिर सदमे क्षेत्र से बचने के लिए एक घूर्णन क्षेत्र के चारों ओर रखे स्थानिक संकेतों का उपयोग करना चाहिए। समायोजित किए जा सकने वाले कई मापदंडों के कारण, एपीए कार्य को एक बहुत ही बहुमुखी दृष्टिकोण के रूप में प्रदर्शित किया गया है। यह चूहों के एक ही समूह के लिए अनुदैर्ध्य और बार-बार उपयोग किए जाने के लिए उधार देता है। यहां, हम एपीए कार्य को सफलतापूर्वक संचालित करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। हम वैकल्पिक एपीए दृष्टिकोणों को भी उजागर करते हैं जिनका उपयोग स्थानिक सीखने के विभिन्न घटकों की जांच के लिए किया जा सकता है। हम डेटा संग्रह और विश्लेषण प्रक्रियाओं का वर्णन करते हैं। एपीए कार्य के दौरान महत्वपूर्ण कदमों पर सफलतापूर्वक परीक्षण आयोजित करने की संभावना बढ़ाने के लिए चर्चा की जाती है। एपीए कार्य में अधिक पारंपरिक स्थानिक नेविगेशन परीक्षणों पर कई फायदे हैं। वृद्ध चूहों या अल्जाइमर रोग जैसे रोग फेनोटाइप वाले लोगों के साथ उपयोग करना उचित है। कार्य की जटिलता को आसानी से बदला जा सकता है, जिससे माउस उपभेदों की एक विस्तृत श्रृंखला का परीक्षण किया जा सकता है। इसके अलावा, एपीए कार्य उन जानवरों के परीक्षण के लिए उपयुक्त है जो सर्जरी या प्रयोगात्मक हस्तक्षेप से गुजर चुके हैं जो मोटर या तंत्रिका कार्य, जैसे स्ट्रोक या दर्दनाक मस्तिष्क की चोट को प्रभावित कर सकते हैं।
Introduction
सक्रिय स्थान परिहार (एपीए) कृन्तकों 1,2,3,4 में हिप्पोकैम्पस-निर्भर स्थानिक सीखने का परीक्षण करने के लिए एक प्रभावी उपकरण है। एपीए कार्य के दौरान, जानवर को एक घूर्णन क्षेत्र पर रखा जाता है और खुद को उन्मुख करने और एक प्रतिकूल सदमे क्षेत्र5 से बचने के लिए दृश्य संकेतों का उपयोग करने की आवश्यकता होती है। अखाड़े के रोटेशन माउस नेविगेशन के लिए एक मुहावरेदार दृष्टिकोण का उपयोग करने में असमर्थ है कि सुनिश्चित करता है, और न ही गंध के निशान का इस्तेमाल किया जा सकता है, के रूप में इन संकेतों मंच पर बारी से जबकि सदमे क्षेत्र स्थिररहता है 5. अखाड़े की गति और दिशा को बदलना, साथ ही सदमे क्षेत्र और दृश्य संकेतों का स्थान, चूहों के कई बार 6,7,8 के पुन: परीक्षण की अनुमति देता है। एपीए मॉरिस वाटर भूलभुलैया (एमडब्ल्यूएम) की तुलना में कई अलग-अलग फायदे प्रदान करता है, जो सबसे व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले स्थानिक शिक्षण परीक्षणों में से एक है। महत्वपूर्ण बात, चूहों तैराकी के लिए एक घृणा है और MWM कार्य अत्यंत तनावपूर्ण9 पाते हैं. इसके अलावा, वृद्ध चूहों MWM कार्य10 के दौरान तैरने के लिए सूचित किया गया है, यह कई मामलों में एक स्थानिक सीखने कार्य के रूप में अनुपयुक्त बनाने. इसके अलावा, MWM कार्य के रूप में परीक्षण के दौरान पता लगाने के लिए चूहों के लिए एक छिपे हुए, जलमग्न मंच की आवश्यकता होती है। इसके लिए पानी को अपारदर्शी होने की आवश्यकता होती है, जिसे आमतौर पर सफेद पेंट के अतिरिक्त के माध्यम से प्राप्त किया जाता है। व्यवहार कार्यों के दौरान जानवरों की ट्रैकिंग और विश्लेषण के लिए विषय और चारों ओर के बीच पर्याप्त विपरीत की आवश्यकता होती है, स्विस या बीएएलबी / सी जैसे कुछ माउस उपभेदों को एमडब्ल्यूएम में परीक्षण करने से छोड़कर। एपीए कार्य में, ग्रिड के तहत काले प्लास्टिक के अतिरिक्त के माध्यम से इस मुद्दे को दरकिनार किया जाता है।
स्थानिक सीखने का परीक्षण करने के लिए कई एपीए प्रतिमानों को डिजाइन किया गया है, जो एक प्रभावी व्यवहार उपकरण के रूप में इसकी उपयोगिता का प्रदर्शन करता है। उदाहरण के लिए, स्थानिक सीखने का अधिग्रहण, प्रतिधारण और समेकन आमतौर पर जानवरों के दैनिक परीक्षण द्वारा पूरा किया जाता है जो 3-5दिनों 6,7,11,12 तक हो सकता है। प्रत्येक अधिग्रहण दिवस प्राप्त झटके की संख्या की तुलना करके स्मृति और सीखने की मात्रा निर्धारित की जाती है। पहले प्रवेश का समय और सदमे क्षेत्र से बचने का अधिकतम समय भी महत्वपूर्ण पैरामीटर हैं जिनका उपयोग कार्य के दौरान सीखने की क्षमता में परिवर्तन को निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, स्थानिक काम कर स्मृति एक एकल, 30 मिनट एपीए सत्र 2,13 जहां स्थानिक सीखने 5 मिनट डिब्बे में सदमे संख्या के रूप में प्रदर्शन की तुलना करके सत्र परिवर्तन के भीतर के रूप में मापा जाता है आयोजित करके परीक्षण किया जा सकता है.
इस लेख में, हम एपीए कार्य का वर्णन करते हैं और उन प्रमुख विशेषताओं पर प्रकाश डालते हैं जिन्हें इस स्थानिक शिक्षण परीक्षण का संचालन करते समय विचार किया जाना चाहिए।
Protocol
सभी पशु प्रक्रियाओं को ऑस्ट्रेलिया के राष्ट्रीय स्वास्थ्य और चिकित्सा अनुसंधान परिषद (अनुमोदन संख्या: QBI/189/15) के दिशानिर्देशों के तहत क्वींसलैंड पशु आचार समिति विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया था।
1. एपीए रूम सेटअप
नोट: एपीए तंत्र में 32 सेमी-उच्च पारदर्शी परिपत्र सीमा से घिरे धातु ग्रिड फर्श के साथ एक ऊंचा क्षेत्र शामिल है। धातु की पट्टियाँ समान रूप से दूरी (0.5 सेमी अलग) हैं और 0.3 सेमी व्यास हैं।
- सुनिश्चित करें कि एपीए उपकरण छत पर लगे कैमरा फ्रेम के भीतर है। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पशु ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग कर माउस ट्रैक.
- एपीए क्षेत्र आम तौर पर 1 आरपीएम गति पर घूमता है, और घूर्णन क्षेत्र के भीतर एक पूर्व-निर्दिष्ट 60 डिग्री स्थिर शॉक ज़ोन सेट किया जाता है। जब माउस सदमे क्षेत्र में प्रवेश करता है, तो 0.5 एमए (60 हर्ट्ज, 500 एमएस) का हल्का पैर झटका दें।
- सुनिश्चित करें कि शॉक ज़ोन का स्थान परीक्षण के दौरान स्थिर रहता है और प्रयोगात्मक सेटअप के भीतर इलेक्ट्रॉनिक रूप से सेट किया जाता है। घूर्णन क्षेत्र माउस को सदमे क्षेत्र में ले जाता है जब तक कि माउस सक्रिय रूप से इससे बचने के लिए नहीं चलता है।
- घूर्णन मंच के रूप में एक ही ऊंचाई पर चार अलग-अलग कमरे की दीवारों पर चार उपन्यास दृश्य संकेत रखें, आमतौर पर अखाड़े से 30-50 सेमी दूर। सुनिश्चित करें कि संकेत तटस्थ रंग हैं, जैसे कि काले और सफेद प्रतीकों या ए 3 पेपर पर मुद्रित आकार और आसान सफाई (चित्रा 1 ए) के लिए टुकड़े टुकड़े।
- सुनिश्चित करें कि कमरे की प्रकाश तीव्रता 30-70 लक्स के बीच है। प्रकाश की तीव्रता बढ़ने से चिंता जैसा व्यवहार होता है और अन्वेषण कम हो जाता है।
- शुरू करने से पहले, ट्रैकर प्रोग्राम खोलें और एपीए कार्य का चयन करें।
- ट्रैकर 2 डी के विकल्प में, प्रयोग टैब चुनें। यहां, सुनिश्चित करें कि प्लेस अवॉइडेंस- वन फ्रेम- पोजीशन ओनली चुना गया है। यह आवश्यक मापदंडों को कॉन्फ़िगर करने की अनुमति देगा। कॉन्फ़िगरेशन फ़ाइल सहेजें और आवश्यकतानुसार समायोजित करें।
- प्रयोग टैब में, प्रयोग समय बॉक्स में प्रयोग अवधि सेट करें. एक विशिष्ट प्रयोग की अवधि 600 सेकंड या 10 मिनट है।
- सुनिश्चित करें कि टाइमर सक्षम करें चयनित है। टाइमर क्षेत्र में शॉक पैरामीटर बदलें जैसा कि ऊपर चर्चा की गई है।
- प्रयोग टैब के कक्ष फ़्रेम क्षेत्र में प्रदान की अंतरिक्ष में आम प्रयोगात्मक विवरण दर्ज करें. उदाहरण के लिए, सुनिश्चित करें कि डिफ़ॉल्ट आउटपुट फ़ाइल नाम दिनांक, एक साधारण प्रयोगात्मक पहचानकर्ता और परीक्षण के दिन के साथ पॉप्युलेट है। प्रयोग के दौरान एक अद्वितीय माउस आईडी जोड़ने की अनुमति देने के लिए एक अंडरस्कोर "_" के साथ नाम समाप्त करें।
- रूम फ़्रेम क्षेत्र में लक्ष्य टैब भी है। दबाएं संपादित करें यह सुनिश्चित करने की क्षमता प्रदान करने के लिए बटन कि संपूर्ण क्षेत्र रुचि के क्षेत्र में शामिल है। फिर, आकार और सदमे लक्ष्य क्षेत्र (चित्रा 1 बी) के स्थान के लिए समायोज्य पैरामीटर प्रदान करने के लिए आर्क का चयन करें।
- सफल चूहों ट्रैकिंग सुनिश्चित करने के लिए मापदंडों को समायोजित करने के लिए ट्रैकिंग टैब खोलें। कंट्रास्ट बॉक्स में डार्क या लाइट विकल्प हैं जो अंधेरे (जैसे, C57Bl/6) या प्रकाश (जैसे, BALB/c) चूहों दोनों के लिए अनुमति देते हैं। यह पृष्ठभूमि और चूहों के बीच एक प्रभावी विपरीत बनाता है। चूहों के अल्बिनो उपभेदों का उपयोग करते समय, इस विपरीत प्राप्त करने के लिए अनुमति देने के लिए अखाड़े के नीचे काले प्लास्टिक का एक टुकड़ा रखें(चित्र 2)।
- इस क्षेत्र में चूहों का आकार और क्षेत्र पर्वतमाला सेट करें। प्रभावी ढंग से माउस को पहचानने के लिए इन मापदंडों सेट जब क्षेत्र में. वैकल्पिक रूप से, From Calibrator बटन दबाने के बाद इन्हें सेट करें।
- यह सुनिश्चित करने के लिए अंशशोधक से बटन का चयन करें कि अखाड़ा पूरी तरह से रुचि मास्क के क्षेत्र में है।
- यह सुनिश्चित करने के लिए इस टैब में अखाड़ा शुरू करें कि जब अखाड़ा घूमता है, तो अखाड़ा मुखौटा में रहता है। उपयुक्त कंट्रास्ट थ्रेशोल्ड का चयन करने के लिए यह टैब भी महत्वपूर्ण है। कंट्रास्ट थ्रेशोल्ड समायोजित करने के लिए थ्रेशोल्ड फलक में लाल रेखा को ले जाएँ.
नोट: चित्रा 3 ए एक इष्टतम थ्रेशोल्ड चयन दिखाता है, जैसा कि एक ठोस नारंगी क्षेत्र और एक नीला "एक्स" द्वारा प्रमाणित है जहां माउस स्थित है। एक गरीब दहलीज चित्रा 3 बी में दिखाया गया है और केवल धब्बेदार नारंगी और कोई "एक्स" से पता चलता है.
- यह सुनिश्चित करने के लिए इस टैब में अखाड़ा शुरू करें कि जब अखाड़ा घूमता है, तो अखाड़ा मुखौटा में रहता है। उपयुक्त कंट्रास्ट थ्रेशोल्ड का चयन करने के लिए यह टैब भी महत्वपूर्ण है। कंट्रास्ट थ्रेशोल्ड समायोजित करने के लिए थ्रेशोल्ड फलक में लाल रेखा को ले जाएँ.
- डिवाइस टैब का उपयोग करें और वेग बटन का उपयोग करके अखाड़े की रोटेशन दिशा और गति निर्धारित करें। सकारात्मक और नकारात्मक दोनों वेगों का चयन करें, जो दक्षिणावर्त और वामावर्त घुमावों का प्रतिनिधित्व करते हैं। वर्तमान स्रोत अनुभाग में सदमे की तीव्रता सेट करें। चूहों के लिए सबसे आम सेटिंग 1 आरपीएम रोटेशन और 0.5 एमए झटका है।
- वर्तमान स्रोत टैब के भीतर झटके देने का तरीका या समय बदलें।
- सुनिश्चित करें कि निर्भर ट्रैक करने के लिए वर्तमान मोड चयनित है। यह एक बिजली का झटका प्रदान करेगा जब माउस सदमे क्षेत्र में जाता है।
- उपयोगकर्ता द्वारा निर्धारित समय अंतराल पर झटके देने के लिए समय का चयन करें। फ़ाइल से का चयन करके माउस को झटका देने के लिए पहले से रिकॉर्ड किए गए ट्रैक का उपयोग करें। यह स्थानिक सीखने से स्वतंत्र एक ही अवधि और तीव्रता पर झटके की एक समान संख्या के अधीन एक योक्ड नियंत्रण माउस प्रदान करना है।
नोट: फ़ाइल आउटपुट और विंडो टैब डेटा और वीडियो फ़ाइलों को एक विशिष्ट निर्देशिका में सहेजने की अनुमति देते हैं। फ़ाइल आउटपुट टैब के भीतर छवि से बटन भी रुचि के क्षेत्र को चयनित किए जाने वाले पूरे क्षेत्र को कैप्चर करने की अनुमति देता है।
- पर्दे के पीछे पीछे हटें और परीक्षण शुरू करें। अखाड़े के करीब प्रयोगकर्ता की उपस्थिति और कोई भी अनावश्यक शोर जानवरों के प्रदर्शन को प्रभावित कर सकता है।
- सुनिश्चित करें कि परीक्षण के दौरान कोई शोर और गंध सीमित है, जो माउस को एक और क्यू प्रदान कर सकता है, जिससे उनका प्रदर्शन प्रभावित होता है। इसे कम करने के उदाहरणों में एक बंद नैदानिक अपशिष्ट बिन सुनिश्चित करना, शोर प्रयोगशाला स्थानों से हटाए गए कमरों का उपयोग करना और चूहों के बीच उपकरणों को अच्छी तरह से साफ करना शामिल है। शोधकर्ता असंबंधित बाहरी शोर को मुखौटा करने के लिए सफेद शोर जनरेटर का उपयोग करने पर विचार कर सकते हैं।
- व्यवहार परीक्षण अवधि के दौरान घर के पिंजरे के बिस्तर को समान रहने दें, क्योंकि यह नई उत्तेजना प्रदान कर सकता है और व्यवहार को प्रभावित कर सकता है।
- दैनिक विविधताओं से बचने के लिए, प्रत्येक दिन एक सुसंगत समय पर परीक्षण करें।
2. प्रयोगकर्ता से निपटने की आदत
- परीक्षण से पहले कम से कम 2-3 दिनों के लिए 30 एस से 1 मिनट के लिए दैनिक प्रत्येक माउस को संभालें। पशु हैंडलिंग परीक्षण के दौरान तनाव और चिंता से संबंधित व्यवहार को काफी कम कर देता है।
- एक ही लैब कोट का उपयोग करें और आदत और परीक्षण के दौरान मजबूत डिओडोरेंट, कोलोन या इत्र पहनने से बचें।
3. एपीए क्षेत्र के लिए आदत (1 दिन)
- आदत के लिए माउस को एंटरूम या परीक्षण कक्ष में लाएं। माउस को कम से कम 30 मिनट के लिए आदत डालने के लिए छोड़ दें। चूहों को आदत डालने के लिए लाए जाने से पहले एंटरूम या परीक्षण कक्ष में प्रकाश की तीव्रता निर्धारित करें।
- ट्रैकर सॉफ्टवेयर सेट करें।
- एक प्रयोग-विशिष्ट फ़ोल्डर बनाएं. प्रयोगात्मक प्रतिमान के आधार पर, प्रत्येक दिन या परीक्षण के लिए अलग फ़ोल्डर्स है. ऊपर बताए गए तरीके से प्रयोग कॉन्फ़िगरेशन सेट अप करें और भविष्य में इस्तेमाल करने के लिए इन कॉन्फ़िगरेशन को सेव करें.
- परीक्षण शुरू करने से पहले, फ़ाइल टैब पर क्लिक करके सहेजे गए कॉन्फ़िगरेशन को खोलें, फिर सहेजें प्रतीक पर क्लिक करें, नई खुली विंडो में एक अद्वितीय माउस आईडी जोड़ें, और प्ले टैब दबाकर परीक्षण चलाएं।
- झटके देने के बिना 5 मिनट के लिए घूर्णन क्षेत्र के लिए यह उजागर करके एपीए तंत्र के लिए माउस आदत.
- यह पूंछ के आधार से उठाने और धीरे दस्ताने हाथ पर रखकर घर पिंजरे से माउस निकालें. माउस को एपीए तंत्र में ले जाएं और इसे दीवार का सामना करते हुए, सदमे क्षेत्र से दूर रखें।
- पर्दे के पीछे पीछे हटें और परीक्षण शुरू करें।
- परीक्षण के अंत में, माउस को हटा दें और घर पिंजरे में लौटें।
- सभी मूत्र और स्कैट ले लीजिए, और 80% (वी / वी) इथेनॉल के साथ ग्रिड को अच्छी तरह से साफ करें।
- सभी चूहों के लिए 3.4-3.7 कदम दोहराएँ.
4. एपीए का उपयोग कर अधिग्रहण प्रशिक्षण (1-6 दिन)
- कमरे की रोशनी को आदत के दिन के समान परिस्थितियों में सेट करें।
- माउस को एंटरूम या परीक्षण कक्ष में लाएं और इसे कम से कम 30 मिनट के लिए आदत डालने दें।
- ऊपर बताए अनुसार ट्रैकर सॉफ़्टवेयर सेट करें।
- परीक्षण की अवधि निर्धारित करें।
- सुनिश्चित करें कि वर्तमान स्रोत चालू है और सेट है (यानी, 0.5 एमए)।
- माउस को शॉक ज़ोन से दूर और दीवार का सामना करते हुए अखाड़े पर रखें।
- पर्दे के पीछे पीछे हटें और प्ले बटन दबाकर परीक्षण शुरू करें। कंप्यूटर स्क्रीन पर माउस की निगरानी करें और यदि आवश्यक हो तो हस्तक्षेप करें। उदाहरण के लिए, माउस झटके प्राप्त नहीं कर रहा है या अत्यधिक तनावग्रस्त दिखाई देता है, जैसा कि अत्यधिक कूदने या मुखर होने से स्पष्ट है।
- परीक्षण के अंत में, माउस को हटा दें और घर पिंजरे में लौटें।
नोट: सुनिश्चित करें कि चूहों प्राप्त कर रहे हैं और झटके पर प्रतिक्रिया कर रहे हैं. चूहे पीछे हटकर और मुखर होकर सदमे का जवाब देते हैं। यदि ऐसा नहीं है, तो उन्हें झटका नहीं मिल सकता है। यह ग्रिड पर स्कैट के कारण या अपर्याप्त ट्रैकिंग के कारण हो सकता है। इसलिए, प्रत्येक परीक्षण के बाद ग्रिड की सफाई और माउस ट्रैकिंग का अनुकूलन, जैसा कि ऊपर चर्चा की गई है, आवश्यक है।
5. उलट अधिग्रहण प्रशिक्षण (वैकल्पिक, 1-6 दिन)
- उत्क्रमण कार्य में, सदमे क्षेत्र को एक नए स्थान पर बदलें, आमतौर पर पिछली स्थिति से 180 °। माउस की क्षमता का आकलन लचीले ढंग से एक उपन्यास सदमे क्षेत्र स्थान जानने के लिए. कमरे के संकेत आमतौर पर उलट सीखने के दौरान नहीं बदले जाते हैं।
- सभी चूहों के लिए 3.4-3.7 कदम दोहराएँ.
6. जांच परीक्षण (वैकल्पिक, 1 दिन)
- जांच परीक्षण में, पहले प्रवेश द्वार के समय और/या सदमे क्षेत्र से बचने के अधिकतम समय को मापें।
नोट:: यह प्राप्ति चरण के बाद स्मृति समेकन इंगित करता है। एक अच्छी तरह से प्रशिक्षित माउस स्थानिक सीखने का सबूत दिखाते हुए, लंबे समय तक (>60 सेकंड) के लिए सदमे क्षेत्र में प्रवेश करने से बच जाएगा। - अधिग्रहण प्रशिक्षण दिवस के रूप में कमरे की रोशनी की तीव्रता निर्धारित करें।
- 30 मिनट के लिए परीक्षण कक्ष या कमरे में माउस आदत.
- ट्रैकर सॉफ्टवेयर सेट करें।
- परीक्षण अवधि को पहले आयोजित परीक्षण अवधि के समान समय पर सेट करें (उदाहरण के लिए, परीक्षण मापदंडों के आधार पर 10 मिनट या 30 मिनट)।
- इस परीक्षण के लिए झटके न दें।
- माउस को प्रतिकूल सदमे क्षेत्र के विपरीत दिशा में रखें, दीवार का सामना करना पड़ रहा है।
- परीक्षण शुरू करें और पर्दे के पीछे पीछे हटें।
- सुनिश्चित करें कि माउस कुशलता से ट्रैक किया गया है।
- कंप्यूटर स्क्रीन पर माउस की निगरानी करें और जब यह सदमे क्षेत्र में प्रवेश करता है तो परीक्षण को रोक दें। कुछ शोधकर्ताओं को 5 मिनट के लिए परीक्षण जारी रखने के लिए देखने के लिए अगर माउस सदमे क्षेत्र में वापस करने के लिए जारी है पसंद करते हैं.
- धीरे माउस उठाओ और घर पिंजरे में लौटें.
- सुनिश्चित करें कि सभी मूत्र और स्कैट एकत्र किए गए हैं, और ग्रिड को 80% (वी / वी) इथेनॉल के साथ अच्छी तरह से साफ किया जाता है।
7. ट्रैक विश्लेषण
नोट: कार्य का प्रदर्शन विभिन्न ट्रैकिंग सॉफ़्टवेयर के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है। नीचे बताया गया है कि एपीए कार्य के दौरान प्रदर्शन को निर्धारित करने के लिए शामिल सॉफ़्टवेयर का उपयोग कैसे किया जाता है। इस उदाहरण में, ट्रैक विश्लेषण कार्यक्रम का उपयोग करके डेटा का विश्लेषण किया जाता है।
- डेटा का विश्लेषण करने के लिए, ट्रैक विश्लेषण कार्यक्रम खोलें और मुख्य विंडो में ड्रॉपडाउन मेनू से परिहार का चयन करें।
- एक नई विंडो में अधिग्रहण चरण के दौरान सहेजी गई डेटा फ़ाइलों को अपलोड करने के लिए कार्य जोड़ें पर क्लिक करें। समूह नाम में, विश्लेषण करने के लिए एक समूह बनाएं, उदाहरण के लिए, दिन 1 या विश्लेषण का समय।
- विश्लेषण किए गए डेटा को सहेजने के लिए स्थान का चयन करने के लिए आउटपुट निर्देशिका पर क्लिक करें।
- पर क्लिक करके विश्लेषण की जाने वाली फ़ाइलों को जोड़ें फाइलें जोड़ो टैब और स्थानीय ड्राइव से फ़ाइलों का चयन करें।
- समय सेट करें टैब पर क्लिक करके विश्लेषण किए जाने का समय निर्धारित करें। यह उस अवधि को परिभाषित करने की क्षमता प्रदान करता है जिसका विश्लेषण किया जाएगा, अर्थात, 0 से 600 सेकंड। वैकल्पिक रूप से, डिब्बे में डेटा का विश्लेषण करें, अर्थात, 60 एस।
- एक बार सभी ट्रैक जुड़ जाने के बाद, विश्लेषण टैब पर क्लिक करें और डेटा का विश्लेषण करने के लिए रन एनालिसिस चुनें। विश्लेषण कई फ़ोल्डरों का उत्पादन करेगा। विश्लेषण के लिए डेटा TBLfiles फ़ोल्डर में होगा। इन डेटा फ़ाइलों को एक स्प्रेडशीट में खोलें और उन्हें आगे के विश्लेषण के लिए उपयोग करें, अर्थात, जोड़ीदार तुलना या दोहराया उपाय एनोवा।
नोट: विश्लेषण भी पीएस फ़ाइलों है कि परीक्षण के दौरान चूहों का एक एकल पृष्ठ विवरण होगा, एक ट्रेस नक्शा दिखा रहा है और जहां झटके प्राप्त हुए सहित अन्य फ़ोल्डरों का उत्पादन होगा.
Representative Results
बरकरार स्थानिक सीखने की क्षमता के साथ चूहे लगातार अधिग्रहण परीक्षणों(चित्रा 4ए)के दौरान झटके की संख्या में कमी दिखाएगा. इसी तरह, सदमे क्षेत्र से बचने के अधिकतम समय में वृद्धि होगी क्योंकि माउस सदमे क्षेत्र(चित्रा 4बी)से सफलतापूर्वक नेविगेट करना सीखता है। हालांकि, चूहों है कि एक प्रभावी परिहार रणनीति जानने में असमर्थ हैं प्रत्येक अधिग्रहण परीक्षण (चित्रा 4 ए) के लिए झटके की एक निरंतर संख्या दिखाएगा. अक्सर, चूहों जो सदमे क्षेत्र की पहचान करने में विफल रहते हैं, उन्हें ज़ोन में प्रत्येक प्रवेश द्वार के दौरान कई झटके मिलेंगे। ट्रेस नक्शे चूहों के उदाहरण प्रदान करने के लिए उपयोगी होते हैं जो सदमे क्षेत्र(चित्रा 4सी)से बचने के लिए सीखते हैं और जो सदमे क्षेत्र(चित्रा 4डी)से बचने में असमर्थ हैं। दोनों उदाहरणों में, ये ट्रेस मानचित्र अधिग्रहण के अंतिम दिन का प्रतिनिधित्व करते हैं। चित्रा 4 सी में माउस केवल 2 झटके प्राप्त किया, के रूप में दो हलकों द्वारा दर्शाया गया है. इसके अलावा, ध्यान दें कि ट्रेस मैप माउस को सदमे क्षेत्र के विपरीत दिशा में ज्यादातर समय बिताने से पता चलता है जो लाल पच्चर द्वारा दर्शाया गया है। इसके विपरीत, चित्रा 4 डी में माउस अधिक झटके प्राप्त किया, और ट्रेस नक्शा एक अव्यवस्थित पैटर्न से पता चलता है. चूहों के उदाहरण जो शॉक ज़ोन से बचने के लिए सफलतापूर्वक सीखने में असमर्थ हैं, वे हैं जिन्होंने वृद्धावस्था के कारण हिप्पोकैम्पस न्यूरोजेनेसिस को कम कर दिया है, जैसा कि 18 महीने के चूहों द्वारा दिखाया गया है (चित्र 4A, B- ब्लैकमोर एट अल., 20217 से संशोधित), अपरिपक्व न्यूरॉन्स6 या हिप्पोकैम्पस घावों का रासायनिक पृथक्करण (कॉड एट अल देखें। 2020)8.
उपकरण के सेट-अप में विफलता के विपरीत माउस सीखने में विफल रहने के कारण असफल परीक्षण के बीच अंतर करना महत्वपूर्ण है। उपकरण की विफलता के कारण खराब परिणामों के दो सबसे आम कारण माउस की खराब ट्रैकिंग (चित्र 5A) या माउस को झटका नहीं मिल रहा है। खराब ट्रैकिंग माउस को झटका प्राप्त करने से रोक सकती है जब यह सदमे क्षेत्र में होता है। वैकल्पिक रूप से, खराब ट्रैकिंग गलत तरीके से एक झटका पैदा कर सकती है जब माउस ज़ोन में नहीं होता है। दोनों उदाहरणों में, यह माउस को एक प्रभावी परिहार रणनीति विकसित करने से रोक देगा। खराब ट्रैकिंग को "अंशशोधक से" टैब में थ्रेशोल्ड को समायोजित करके हल किया जा सकता है। खराब ट्रैकिंग को आमतौर पर 10 मिनट की अवधि के दौरान 1000 से अधिक खराब फ्रेम के रूप में परिभाषित किया जाता है और बहुत कम ही होता है। खराब ट्रैकिंग वृद्ध चूहों के साथ एक मुद्दा बन सकती है, जहां खालित्य विकसित हो सकता है। झटका प्राप्त करते समय, माउस या तो तनाव से प्रतिक्रिया करेगा या, अवसर पर, मुखर होगा। माउस आमतौर पर थोड़ा भी हिलेगा, और लाइव ट्रैकिंग सॉफ़्टवेयर पर देखा जा सकता है। जब माउस सदमे क्षेत्र के भीतर पूरी तरह से अभी भी रहता है, झटके की एक स्पष्ट रेखा (चित्रा 5 बी) दिखाया जाएगा. यह शॉक बॉक्स को चालू नहीं करने या सलाखों के बीच फंसने के कारण हो सकता है, जिससे जानवर को दिए जा रहे झटके के आयाम को कम किया जा सकता है।
चित्रा 1: एपीए उपकरण, व्यवहार कक्ष, और सदमे क्षेत्र सेटिंग। (ए) परीक्षण क्षेत्र और कमरे की स्थापना का एक उदाहरण। एपीए तंत्र ऊंचा है और कमरे के केंद्र में रखा गया है, जो उपन्यास दृश्य संकेतों से घिरा हुआ है। काले और सफेद दृश्य संकेतों का उपयोग मंच के समान ऊंचाई पर किया जाता है। प्रयोग टैब के भीतर लक्ष्य समारोह पूरे क्षेत्र के मास्किंग की अनुमति देता है और सदमे क्षेत्र का एक स्थान बनाता है. इस उदाहरण में लाल कील द्वारा दर्शाया गया एक शॉक ज़ोन 270° पर बनाया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 2: अल्बिनो माउस उपभेदों के लिए एपीए सेटअप। एपीए क्षेत्र को चूहों के अल्बिनो उपभेदों के लिए स्थापित किया जा सकता है, जैसे कि बीएएलबी / सी, ट्रैकिंग टैब में लाइट विकल्प का चयन करके और एक काला क्षेत्र पृष्ठभूमि बनाकर। एक काले रंग की पृष्ठभूमि पर एक अल्बिनो माउस उच्च विपरीत प्राप्त करता है और बेहतर माउस ट्रैकिंग प्रदान करता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 3: माउस ट्रैकिंग के लिए दहलीज का समायोजन आवश्यक है। परीक्षण के दौरान अच्छा पशु ट्रैकिंग सुनिश्चित करने के लिए सीमा को उचित रूप से समायोजित किया जाना चाहिए। थ्रेशोल्ड को फ्रॉम कैलिब्रेटर टैब में थ्रेशोल्ड फलक में लाल रेखा को स्थानांतरित करके समायोजित किया जाता है। (ए) एक ठोस नारंगी क्षेत्र और ऑब्जेक्ट पर एक नीले एक्स के साथ एक अच्छा थ्रेशोल्ड चयन का एक उदाहरण। (बी) धब्बेदार नारंगी के साथ एक गरीब दहलीज। खराब ट्रैकिंग से अखाड़े में किसी जानवर का नुकसान होता है या माउस को झटका लगने से रोकता है जब वह शॉक ज़ोन में होता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 4: 5 दिन सीखने के प्रतिमान और ट्रेस नक्शे पर युवा (10 सप्ताह) और पुराने (18 महीने) चूहों के बीच प्रदर्शन की तुलना। (ए) 10 सप्ताह के चूहों को परीक्षण के 5 दिनों के दौरान 18 महीने के चूहों की तुलना में काफी कम झटके मिले; ध्यान दें कि समूहों के बीच परीक्षण के पहले दिन प्राप्त झटके की संख्या में अंतर कम से कम था, लेकिन बरकरार स्मृति वाले युवा चूहों ने पुराने समूह की तुलना में सदमे क्षेत्र में प्रवेश से बचने के लिए सीखा। (बी) अधिकतम समय से बचाव 10 मिनट परीक्षण के दौरान सदमे से बचने के लिए खर्च किए गए अधिकतम समय के रूप में गणना की गई थी। युवा चूहों ने तेजी से पुराने चूहों की तुलना में सदमे क्षेत्र में प्रवेश से बचने के लिए सीखा, यह सुझाव देते हुए कि युवा चूहों प्रभावी ढंग से सीख रहे हैं। (सी) इस ट्रेस मैप में माउस को केवल दो झटके मिले, जैसा कि इस अधिग्रहण परीक्षण में दो हलकों द्वारा दर्शाया गया है। इस माउस ने शॉक ज़ोन के विपरीत अखाड़े में अधिक समय बिताया, जिसे लाल पच्चर द्वारा दर्शाया गया है। (डी) इस माउस को अधिक झटके मिले और सदमे क्षेत्र के करीब अधिक समय बिताया, यह सुझाव देते हुए कि इस माउस में स्थानिक शिक्षा हासिल नहीं की गई थी। दो-तरफा, बोनफेरोनी पोस्ट हॉक परीक्षणों के साथ दोहराए जाने वाले उपाय एनोवा का उपयोग महत्व का परीक्षण करने के लिए किया गया था। पी<0.0001. पैनल ए और बी को ब्लैकमोर एट अल 7 से संशोधित किया गया था। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 5: ट्रेस नक्शे प्रत्येक परीक्षण के दौरान प्रत्येक माउस के लिए महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान करते हैं। (ए) ट्रैकिंग के इस उदाहरण में मौजूद सीधी रेखाओं पर ध्यान दें। यह ट्रैकिंग सॉफ़्टवेयर द्वारा कार्य के दौरान माउस की गलत पहचान करने के कारण है। (बी) परीक्षण के दौरान अच्छी ट्रैकिंग का एक उदाहरण। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 6: विभिन्न पशु ट्रैकिंग कार्यक्रमों पर ट्रैक विज़ुअलाइज़ेशन और हीटमैप। दोनों (ए) कार्यक्रम 1 और (बी) कार्यक्रम 2 नेत्रहीन निरीक्षण करने के लिए ट्रैक भूखंडों बनाने के लिए जानवर के स्थान और आंदोलन का पता लगाते हैं यदि जानवर कार्य या प्रयोगात्मक उपचार के प्रभाव को सीखता है। दोनों कार्यक्रम एक जानवर से समान ट्रैक भूखंड दिखाते हैं जिसने कार्य को कुशलता से सीखा। (ग) एक हीटमैप भी बनाया जा सकता है, जो हॉटस्पॉट की पहचान और डेटा बिंदुओं के क्लस्टरिंग की सुविधा प्रदान करता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
Discussion
अंत में, सक्रिय स्थान परिहार परीक्षण एक प्रभावी स्थानिक शिक्षण कार्य है जिसका उपयोग विभिन्न माउस उपभेदों और प्रयोगात्मक स्थितियों पर किया जा सकता है। एपीए कार्य अन्य स्थानिक सीखने के प्रतिमान14, जैसे एमडब्ल्यूएम, जो चूहों के लिए तनावपूर्ण है के रूप में कोर्टिसोल के स्तर9 द्वारा मापा के साथ जुड़े सीमाओं पर काबू पाने. MWM भी वृद्ध चूहों, जहां वे कार्य10 के दौरान तैरने के लिए सूचित किया गया है के लिए अनुपयुक्त है. हालांकि अन्य स्थानिक सीखने के परीक्षण, जैसे बार्न्स भूलभुलैया और उपन्यास वस्तु स्थान परीक्षण, कम तनावपूर्ण हैं, वे चूहों के एक ही समूह पर कितनी बार दोहराए जाने वाले परीक्षण से सीमित हैं। इसलिए, एपीए कार्य का मुख्य लाभ यह है कि इसका उपयोग कई बार किया जा सकता है क्योंकि नवीनता बनाए रखने के लिए कई मापदंडों को समायोजित किया जा सकता है। दरअसल, हमने हिप्पोकैम्पस पृथक्करण के प्रभाव औरव्यायाम 8 के बाद के प्रभाव की जांच करने के लिए चूहों के एक ही समूह पर एपीए कार्य का 5 गुना तक उपयोग किया है। प्रत्येक उदाहरण में, मापदंडों अखाड़ा रोटेशन, सदमे क्षेत्र, और स्थानिक cues सहित, परीक्षण के बीच बदल रहे थे. यह सुनिश्चित करने में प्रभावी था कि चूहों ने कार्य को फिर से सीखने के लिए स्थानिक नेविगेशन संकेतों का उपयोग किया, जैसा कि नियंत्रण जानवरों द्वारा उच्च संख्या में झटके से शुरू होता है और फिर प्रत्येक परीक्षण अवधि8 के लिए बाद के परीक्षण दिनों के दौरान कम हो जाता है। आमतौर पर, 5-दिवसीय परीक्षण प्रतिमान के अंत में, हम मानते हैं कि अंतिम दिन 10 से अधिक झटके प्राप्त करने वाले या 60 से कम के अधिकतम परिहार वाले किसी भी जानवर ने प्रतिमान नहीं सीखा है।
स्थानिक परीक्षण के कई दौरों की अनुमति देने के लिए सेटिंग्स को आसानी से संशोधित करने की क्षमता से परे, एपीए कार्य यह सुनिश्चित करता है कि चूहों को सदमे क्षेत्र से प्रभावी ढंग से बचने के लिए स्थानिक नेविगेशन का उपयोग करना चाहिए। उदाहरण के लिए, जानवरों का पता लगाने और यह5 से दूर नेविगेट करके स्थिर सदमे क्षेत्र में प्रवेश करने से बचने के लिए बाहरी संकेतों का उपयोग करना चाहिए. जैसा कि अखाड़ा घूम रहा है, जानवर नेविगेशन के लिए एक मुहावरेदार दृष्टिकोण का उपयोग करने में सक्षम नहीं हैं, न ही वे गंध जैसे बाहरी संकेतों का उपयोग कर सकते हैं क्योंकि ये संकेत अखाड़े के साथ घूमते हैं जबकि सदमे क्षेत्र और स्थानिक संकेत स्थिर रहते हैं5.
यह सुनिश्चित करना भी महत्वपूर्ण है कि चूहों को शोधकर्ता और एपीए क्षेत्र में उचित रूप से आदत हो। पैर के झटके की तीव्रता को भी अनुकूलित करने की आवश्यकता है, क्योंकि बहुत कम और बहुत अधिक सदमे की तीव्रता दोनों चूहोंकी कार्य 5 सीखने और प्रदर्शन करने की क्षमता से समझौता कर सकते हैं। सदमे की तीव्रता आमतौर पर 0.5 एमए पर सेट होती है और 0.7 एमए से अधिक नहीं होनी चाहिए। उन जानवरों के लिए जिन्होंने चिंता जैसे व्यवहार में वृद्धि की है, प्रकाश की तीव्रता और पैर के झटके की तीव्रता दोनों को कम करने पर विचार करें। एपीए कार्य के दौरान बढ़ी हुई चिंता या तो अत्यधिक कूद, अखाड़े के भीतर अनियंत्रित दौड़ने, या लंबे समय तक ठंड के रूप में पेश कर सकती है। यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल 0.5 एमए की एक सदमे तीव्रता का इस्तेमाल किया, एक ही तीव्रता है कि पहले BALB/सी, जो उच्च चिंता की तरह व्यवहार15 है के साथ इस्तेमाल किया गया है.
यहां, हम कंपनी द्वारा आपूर्ति किए गए पशु ट्रैकिंग सॉफ़्टवेयर का वर्णन करते हैं जो सक्रिय स्थान से बचाव रिग का उपयोग करता है। वैकल्पिक वीडियो ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर व्यवहार प्रदर्शन का विश्लेषण करने के लिए भी उपयुक्त है। ये प्रोग्राम एपीए कार्यों के दौरान माउस के प्रदर्शन को सटीक रूप से माप और विश्लेषण भी कर सकते हैं। ये कार्यक्रम व्यवहार का आकलन करने के लिए एपीए क्षेत्र के भीतर कई क्षेत्रों और स्थानों के निर्माण की अनुमति देते हैं। एपीए के लिए अखाड़ा सेटिंग में एक त्रिकोणीय शॉक ज़ोन होता है, जहां प्रवेश द्वारों की संख्या, पहले प्रवेश करने का समय और शॉक ज़ोन में बिताया गया समय मापा जाता है। अखाड़े के भीतर अतिरिक्त जोन भी जोड़े जा सकते हैं। उदाहरण के लिए, हम खर्च किए गए समय को मापने के लिए सदमे क्षेत्र के विपरीत एक केंद्रीय क्षेत्र या एक क्षेत्र जोड़ सकते हैं, और उन क्षेत्रों में यात्रा की गई दूरी को प्रतिकूल क्षेत्र से बचने के लिए एक पशु रणनीति के रूप में तय किया गया है। ये प्रोग्राम द्रव्यमान के माउस केंद्र को ट्रैक करते हैं, जिसे तब दृश्य निरीक्षण के लिए संदर्भ फ्रेम के ऊपर सहेजा और प्रदर्शित किया जाता है (चित्र 6ए,बी)। अंत में, व्यक्तिगत और समूह प्रदर्शन (चित्रा 6 सी) के लिए घनत्व हीटमैप बनाना भी संभव है।
एपीए कार्य का संचालन करते समय, संभावित मुद्दे हैं जिन्हें संबोधित करने की आवश्यकता है। अवसर पर, चूहों सदमे क्षेत्र के लिए गैर जवाबदेही के कारण विश्लेषण से बाहर रखा जाना चाहिए. हमेशा की तरह, बहिष्करण पर केवल तभी विचार किया जाना चाहिए जब वे पूर्व-निर्धारित बाहरी शर्तों को पूरा करते हैं, उदाहरण के लिए, माध्य से 2 मानक विचलन के बाहर गिरना। एपीए जैसे जटिल व्यवहार कार्यों को आमतौर पर जानवरों के उच्च एन मूल्यों की आवश्यकता होती है। हम एपीए का संचालन करने से पहले उचित नमूना आकार की गणना करने के लिए एक शक्ति विश्लेषण आयोजित करने का सुझाव देते हैं। यह इस्तेमाल किए गए तनाव और उपचार समूहों पर निर्भर करेगा। अनुभव से, हम पाते हैं कि एपीए प्रयोगों का संचालन करते समय प्रत्येक समूह के लिए 10 या उससे अधिक का एन मान पर्याप्त शक्ति प्रदान करता है। इस कार्य के साथ मुख्य मुद्दा कार्य के दौरान माउस की उच्च-गुणवत्ता वाली ट्रैकिंग सुनिश्चित करना है। कार्य के आदत चरण का उपयोग यह पुष्टि करने के लिए किया जाना चाहिए कि ऐसा हो रहा है। चूहे एक सदमे का जवाब नहीं अक्सर ग्रिड सलाखों के बीच स्कैट के कारण होता है। इसलिए, प्रत्येक जानवर के बाद रिग को साफ करना और किसी भी स्कैट या मूत्र को निकालना आवश्यक है। यह अनुसरण करने वाले जानवरों के लिए तनाव को भी कम करेगा। एपीए कार्य में आम तौर पर 5-दिवसीय प्रतिमान शामिल होता है, जो 5 दिनों से कम समय के हस्तक्षेप से जुड़े अध्ययनों के लिए कुछ सीमाएं पेश कर सकता है; हालांकि, अल्पकालिक स्मृति या स्थानिक सीखने के अधिग्रहण अभी भी 30 मिनट, एकल सत्र दृष्टिकोण का उपयोग कर इस तरह के अध्ययन के लिए मूल्यांकन किया जा सकता है.
संक्षेप में, यह आलेख चूहों के स्थानिक सीखने का परीक्षण करने के लिए सक्रिय स्थान परिहार प्रतिमान को स्थापित करने और उपयोग करने के तरीके का विस्तृत विवरण प्रदान करता है। स्थितियों को बदलने की क्षमता ताकि अलग-अलग रंग के कई माउस उपभेदों का परीक्षण किया जा सके, एमडब्ल्यूएम जैसे अन्य, अधिक पारंपरिक स्थानिक परीक्षणों पर एक अलग लाभ है। इसके अलावा, कई मापदंडों का संशोधन दोहराने के परीक्षण के लिए अनुमति देता है ताकि स्थानिक सीखने में परिवर्तन की तुलना विभिन्न प्रयोगात्मक प्रतिमानों के दौरान या शारीरिक उम्र बढ़ने के दौरान सटीक रूप से की जा सके। थोड़े समय में, एपीए परीक्षण को हिप्पोकैम्पस-निर्भर स्थानिक सीखने के लिए एक सटीक और प्रभावी विकल्प के रूप में प्रदर्शित किया गया है। भविष्य में, एपीए कार्य का उपयोग जंगली प्रकार और ट्रांसजेनिक चूहों दोनों में संज्ञानात्मक और स्थानिक व्यवहार पर चिकित्सीय या व्यायाम हस्तक्षेप का आकलन करने के लिए एक विश्वसनीय विधि के रूप में किया जा सकता है।
Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
हम इस पांडुलिपि में वर्णित तंत्र के विकास और रखरखाव के लिए क्वींसलैंड ब्रेन इंस्टीट्यूट (QBI) पशु व्यवहार सुविधा का धन्यवाद करते हैं।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Constant Current Source CS02 | BioSignal Group | N/A | Acton, Massachusetts, United States |
| Control Box | BioSignal Group | N/A | Acton, Massachusetts, United States |
| Ethovision | Noldus | version 16 | Wageningen, Netherlands |
| Shock Scrambler | BioSignal Group | N/A | Acton, Massachusetts, United States |
| Track Analysis | BioSignal Group | version 2.2 | Acton, Massachusetts, United States |
| Tracker Programme | BioSignal Group | version: 2.36 | Acton, Massachusetts, United States |
References
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