Il protocollo qui presentato consente l'identificazione e l'analisi ad alta dimensionalità delle cellule staminali muscolari e delle cellule progenitrici mediante citometria di massa a singola cellula e la loro purificazione mediante FACS per studi approfonditi della loro funzione. Questo approccio può essere applicato per studiare le dinamiche di rigenerazione in modelli di malattia e testare l'efficacia degli interventi farmacologici.
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Articolo metodologico
Identificazione e analisi di progenitori miogenici in vivo durante la lesione acuta del muscolo scheletrico mediante citometria di massa unicellulare ad alta dimensionalità
In questo articolo
Sommario
Abstract
La rigenerazione muscolare scheletrica è un processo dinamico guidato dalle cellule staminali muscolari adulte e dalla loro progenie. Per lo più quiescenti in uno stato stazionario, le cellule staminali muscolari adulte si attivano in seguito a una lesione muscolare. Dopo l'attivazione, proliferano e la maggior parte della loro progenie si differenzia per generare cellule muscolari competenti per la fusione, mentre le rimanenti si autorinnovano per ricostituire il pool di cellule staminali. Mentre l'identità delle cellule staminali muscolari è stata definita più di un decennio fa, sulla base della co-espressione di marcatori di superficie cellulare, i progenitori miogenici sono stati identificati solo di recente utilizzando approcci unicellulari ad alta dimensione. Qui, presentiamo un metodo di citometria di massa a singola cellula (citometria a tempo di volo [CyTOF]) per analizzare le cellule staminali e le cellule progenitrici in lesioni muscolari acute per risolvere le dinamiche cellulari e molecolari che si svolgono durante la rigenerazione muscolare. Questo approccio si basa sulla rilevazione simultanea di nuovi marcatori di superficie cellulare e fattori chiave di trascrizione miogenica la cui espressione dinamica consente l'identificazione di cellule staminali attivate e popolazioni di cellule progenitrici che rappresentano punti di riferimento della miogenesi. È importante sottolineare che viene descritta una strategia di smistamento basata sul rilevamento dei marcatori di superficie cellulare CD9 e CD104, che consente l'isolamento prospettico delle cellule staminali muscolari e delle cellule progenitrici utilizzando la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS) per studi approfonditi della loro funzione. Le cellule progenitrici muscolari forniscono un anello mancante critico per studiare il controllo del destino delle cellule staminali muscolari, identificare nuovi bersagli terapeutici per le malattie muscolari e sviluppare applicazioni di terapia cellulare per la medicina rigenerativa. L'approccio qui presentato può essere applicato allo studio delle cellule staminali muscolari e delle cellule progenitrici in vivo in risposta a perturbazioni, come gli interventi farmacologici mirati a specifiche vie di segnalazione. Può anche essere utilizzato per studiare le dinamiche delle cellule staminali muscolari e delle cellule progenitrici in modelli animali di malattie muscolari, facendo progredire la nostra comprensione delle malattie delle cellule staminali e accelerando lo sviluppo di terapie.
Introduzione
Il muscolo scheletrico costituisce il tessuto più grande per massa del corpo e regola molteplici funzioni, dalla vista alla respirazione, dalla postura al movimento, nonché al metabolismo1. Pertanto, mantenere l'integrità e la funzione del muscolo scheletrico è fondamentale per la salute. Il tessuto muscolare scheletrico, costituito da fasci stretti di miofibre multinucleate circondate da una complessa rete di nervi e vasi sanguigni, mostra un notevole potenziale rigenerativo 1,2.
I principali motori della rigenerazione del m....
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Protocollo
Le procedure sugli animali sono state approvate dall'ispettorato danese per gli esperimenti sugli animali (protocollo # 2022-15-0201-01293) e gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con le linee guida istituzionali dell'Università di Aarhus. L'analgesia (buprenorfina) viene fornita in acqua potabile 24 ore prima dell'infortunio affinché i topi si adattino al gusto. La fornitura di buprenorfina nell'acqua potabile viene continuata per 24 ore dopo l'infortunio. Insieme a un'iniezione sottocutanea (s.c.) di buprenorfina al momento della lesione muscolare acuta, la buprenorfina nell'acqua potabile dopo l'iniezione di notexin allevierà il dolore associato alla le....
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Risultati
Qui presentiamo una panoramica della configurazione sperimentale per l'utilizzo di questo approccio combinato che include (i) l'analisi CyTOF ad alta dimensionalità di un decorso temporale di lesione acuta mediante iniezione di notexin per studiare la dinamica cellulare e molecolare delle cellule staminali e progenitrici nel muscolo scheletrico (Figura 1, schema in alto); e (ii) FACS di cellule staminali e progenitrici utilizzando due marcatori di superficie cellulare, CD9 e CD104, per isola.......
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Discussione
La rigenerazione muscolare scheletrica è un processo dinamico che si basa sulla funzione delle cellule staminali adulte. Mentre studi precedenti si sono concentrati sul ruolo delle cellule staminali muscolari durante la rigenerazione, la loro progenie in vivo è stata poco studiata, principalmente a causa della mancanza di strumenti per identificare e isolare queste popolazioni cellulari 15,16,17,18.
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.
Ringraziamenti
Ringraziamo i membri della FACS Core Facility del Dipartimento di Biomedicina dell'Università di Aarhus per il supporto tecnico. Ringraziamo Alexander Schmitz, direttore dell'Unità di Citometria di Massa presso il Dipartimento di Biomedicina, per il confronto e il supporto. Le illustrazioni scientifiche sono state create utilizzando Biorender.com. Questo lavoro è stato finanziato da una sovvenzione Starting Grant dell'Aarhus Universitets Forskningsfond (AUFF) e da una sovvenzione Start Package (0071113) della Novo Nordisk Foundation a E.P.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Provetta da centrifuga da 15 mL | Fisher Scientific | 07-200-886 | |
| ago da 20 G | KDM | KD-fine 900123 | |
| siringa da insulina da 28 g, 0,5 mL | Siringa da | 329461 | |
| 29 G, 0,3 mL | 324702 | ||
| Siringhe da 3 mL Terumo | medical | MDSS03SE | |
| 40 &; filtri cellulari m | Fisher Scientific | 11587522 | |
| provette in polipropilene da 5 mL | Fisher Scientific | 352002 | |
| Provette in polistirene da 5 mL con 35 µ filtro per cellule m | Falcon | 352235 | |
| siringhe da 5 mL | Terumo medical | SS05LE1 | |
| provetta da centrifuga da 50 mL | Fisher Scientific | 05-539-13 | |
| 5-Iodo-2-deossiuridina (IdU) | Merck | I7125-5g | |
| anti-CD104 FITC (clone: 346-11A) | Biolegend | 123605 | Stock = 0,5 mg/mL |
| anti-CD11b APC-Cy7 (clone: M1/70Biolegend | 101226 | Stock = 0,2 mg/mL | |
| anti-CD31 APC-Cy7 (clone: 390) | Biolegend | 102440 | Stock = 0,2 mg/mL |
| anti-CD45 APC-Cy7 (clone: 30-F11) | Biolegend | 103116 | Stock = 0,2 mg/mL |
| anti-CD9 APC (clone: KMC8) | ThermoFisher Scientific | 17-0091-82 | Stock = 0,2 mg/mL |
| anti-Sca1 (Ly6A/E) APC-Cy7 (clone: D7) | Biolegend | 108126 | Stock = 0,2 mg/mL |
| anti-&alfa; 7 integrina PE (clone: R2F2)) | UBC AbLab | 67-0010-05 | Stock = 1 mg/mL |
| BD FACS Aria III (4 laser) strumento | BD Biosciences | N/A | 405, 488, 561 e 633 nm |
| laser Albumina sierica bovina | Sigma Aldrich | A7030-50G | |
| Buprenorfina 0,3 mg/mL | Ceva Vnr 054594 | ||
| CD104 (clone: 346-11A) | BD Biosciences | 553745 | Dy162; |
| CD106/VCAM-1 coniugato in-house (clone: 429 MVCAM. A) | Biolegend | 105701 | Er170; CD11b coniugato in-house |
| (clone: M1/70) | BD Biosciences | 553308 | Nd148; |
| CD29/Integrina e beta coniugati internamente; 1 (clone: 9EG7) | BD Biosciences | 553715 | Tm169; CD31 coniugato in-house |
| (clone: MEC 13.3) | BD Biosciences | 557355 | Sm154; CD34 coniugato in-house |
| (clone: RAM34) | BD Biosciences | 551387 | Lu175; CD44 coniugato in-house |
| (clone: IM7) | BD Biosciences | 550538 | Yb171; CD45 coniugato in-house |
| (clone: MEC 30-F11) | BD Biosciences | 550539 | Sm147; CD9 coniugato in-house |
| (Clone: KMC8) | Thermo Fisher Scientific | 14-0091-85 | Yb174; |
| CD90.2/Thy1.2 coniugato in-house (clone: 30-H12) | BD Biosciences | 553009 | Nd144; CD98 coniugato in-house |
| (clone: H202-141) | BD Biosciences | 557479 | Pr141; Soluzione di acquisizione cellulare coniugata in-house |
| /Maxpar tampone CAS | Standard Biotools | 201240 | |
| Cell-ID Intercalator-Iridium | Standard Biotools | 201192B | Intercalatore di acido nucleico cationico |
| Cisplatino | Merck | P4394 | Pt195 |
| Cisplatino (cis-Diamminplatinum(II) dichloride) | Merck | P4394 | |
| Trasparente 1,5 mL tubo | Fisher Scientific | 11926955 | |
| Collagenase, Tipo II | Worthington Biochemical Corporation | LS004177 | |
| Camera di conteggio | Merck | BR718620-1EA | |
| CXCR4/SDF1 (Clone: 2B11/CXCR4 ) | BD Biosciences | 551852 | Gd158; Coniugato in-house |
| DAPI (1 mg/mL) | BD Biosciences | 564907 | |
| Scuro Tubo da 1,5 mL | Fisher Scientific | 15386548 | |
| Dispase II | Thermo Fisher Scientific 17105041 | ||
| Forbici da dissezione | Fine Science Tools | 14568-09 | |
| DMEM (a basso contenuto di glucosio, con piruvato) | Thermo Fisher Scientific | 11885-092 | |
| EDTA (sale disodico dell'acido etilendiamminotetraacetico) | Merck | E5134 | Na2EDTA-2H20 |
| EQ Perle di calibrazione a quattro elementi (perle EQ) | Standard Biotools | 201078 | Perle di calibrazione |
| Siero fetale bovino, qualificato, origine brasiliana | Thermo Fisher Scientific | 10270106 | |
| Pinza Dumont #5SF | fine Strumenti scientifici | 11252-00 | |
| Pinze Dumont #7 | Hounisen.com | 1606.3350 | |
| Siero di capra | Thermo Fisher Scientific | 16210-072 | |
| Sistema Helios CyTOF | Standard Biotools | N/A | |
| Siero di cavallo, inattivato termicamente, origine neozelandese | Thermo Fisher Scientific | 26-050-088 | |
| IdU | Merck | I7125 | I127 |
| Iridio-Intercalatore | Standard Biotools | 201240 | Ir191/193 |
| Isoflurano/Attano Vet | ScanVet | Vnr 055226 | |
| Metanolo | Fisher Scientific | M/3900/17 | |
| Myf5 (clone: C-20) | Santa Cruz Biotechnology | Sc-302 | Yb173; MyoD coniugato interno |
| (clone: 5.8A) | BD Biosciences | 554130 | Dy164; MyoG coniugato interno |
| (clone: F5D) | BD Biosciences | 556358 | Gd160; Flacone |
| monouso sterile Nalgene coniugato in-house 0,20 μ M PES Filtri | Thermo Fisher Scientific | 595-4520 | |
| Notexin | Latoxan | L8104 | Risospensione a 50 µ g/ml in PBS sterile. Mantieni le scorte (es. 50 µ l) a -20 gradi C |
| Miscela di nutrienti F-10 (Ham's) | Thermo Fisher Scientific 31550031 | ||
| pAkt (Clone: D9E) | Standard Biotools | 3152005A | Sm152 |
| Pax7 (Clone: PAX7) | Santa Cruz Biotechnology | Sc-81648 | Eu153; |
| Penicillina-streptomicina coniugata in-house (10.000 U/mL) (Pen/Strep) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Unità filtranti PES 0,20 μ M | Fisher Scientific | 15913307 | |
| Filtro per siringa PES | Fisher Scientific | 15206869 | |
| Piastra di | Petri Sarstedt | 82.1472.001 | |
| PFA 16% | grado EM MP Biomedicals | 219998320 | |
| Cloruro di potassio (KCl) | Fisher Scientific | 10375810 | |
| Fosfato di potassio, monobasico, anidro (KH2PO4) | Fisher Scientific 10573181 | ||
| pRb (clone: J112-906) | Standard Biotools | 3166011A | Er166 |
| pS6 chinasi (clone: N7-548) | Standard Biotools | 3172008A | Yb172 |
| Sca-1 (clone: E13-161.7) | BD Biosciences | 553333 | Nd142; Sodio azide coniugato |
| Sigma Aldrich | S2002 | ||
| Cloruro di sodio (NaCl) | Fisher Scientific | 10553515 | |
| Fosfato di sodio, bibasico, eptaidrato (Na2HPO4-6H2O) | Merck | S9390 | |
| Soluzione salina sterile 0,9% | Fresenius | B306414/02 | |
| &alfa; 7 integrina (clone: 3C12) | MBL international | K0046-3 | Ho165; Coniugato internamente |
Riferimenti
- Mukund, K., Subramaniam, S. Skeletal muscle: A review of molecular structure and function in health and disease. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 12 (1), e1462(2020).
- Feige, P., Brun, C. E., Ritso, M., Rudnicki, M. A. Or....
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Ristampe e permessi
