Summary
تقدم هذه الدراسة طريقة آلية لتوليد عضويات 3 الأبعاد للورم الأرومي الدبقي المشتق من المريض باستخدام مروحية الأنسجة. توفر الطريقة نهجا مناسبا وفعالا للحصول على هذه المواد العضوية للاختبار العلاجي.
Abstract
الورم الأرومي الدبقي ، IDH-wild type ، CNS WHO من الدرجة 4 (GBM) هو ورم دماغي أولي مرتبط بضعف بقاء المريض على قيد الحياة على الرغم من العلاج القوي. لا يزال تطوير نماذج واقعية خارج الجسم الحي يمثل تحديا. توفر نماذج الأعضاء ثلاثية الأبعاد (PDO) المشتقة من المريض منصات مبتكرة تلتقط عدم التجانس الظاهري والجزيئي ل GBM ، مع الحفاظ على الخصائص الرئيسية للأورام الأصلية. ومع ذلك ، فإن التشريح اليدوي لتوليد PDO يستغرق وقتا طويلا ومكلفا ويمكن أن يؤدي إلى عدد من PDOs غير المنتظمة وغير المتساوية الحجم. تقدم هذه الدراسة طريقة مبتكرة لإنتاج شركة تنمية نفط عمان باستخدام مفرمة الأنسجة الآلية. تمت معالجة عينات الورم من أربعة GBM وورم نجمي واحد ، IDH-mutant ، CNS WHO من الدرجة 2 يدويا وكذلك باستخدام مروحية الأنسجة. في النهج اليدوي ، تم تشريح مادة الورم باستخدام المشارط تحت التحكم المجهري ، بينما تم استخدام مروحية الأنسجة في ثلاث زوايا مختلفة. بعد الاستزراع على شاكر مداري عند 37 درجة مئوية ، تم تقييم التغيرات المورفولوجية باستخدام المجهر المجهري للمجال الساطع ، بينما تم تقييم الانتشار (Ki67) وموت الخلايا المبرمج (CC3) بواسطة التألق المناعي بعد 6 أسابيع. خفضت طريقة مفرمة الأنسجة ما يقرب من 70٪ من وقت التصنيع وأدت إلى ارتفاع كبير في متوسط عدد PDOs مقارنة بالأنسجة المعالجة يدويا من الأسبوع الثاني فصاعدا (الأسبوع 2: 801 مقابل 601 ، P = 0.018 ؛ الأسبوع 3: 1105 مقابل 771 ، P = 0.032 ؛ والأسبوع 4: 1195 مقابل 784 ، P < 0.01). كشف تقييم الجودة عن معدلات مماثلة من موت الخلايا المبرمج للخلايا السرطانية وانتشارها لكلتا طريقتي التصنيع. لذلك ، توفر طريقة مفرمة الأنسجة الآلية نهجا أكثر كفاءة من حيث الوقت وعائد PDO. هذه الطريقة تبشر بالخير لفحص الأدوية أو العلاج المناعي لمرضى GBM.
Introduction
الأورام الدبقية منخفضة الدرجة (LGGs) هي مجموعة من أورام الدماغ النادرة نسبيا والتي تظهر عادة على أنها بطيئة النمو وأقل عدوانية مقارنة بالأورام الدبقية عالية الدرجة مثل الورم الأرومي الدبقي. يمكن أن تحدث في كل من البالغين والأطفال ، مع انتشار أعلى قليلا في البالغين. يختلف الانتشار الدقيق حسب المنطقة والسكان ، لكن LGGs تمثل حوالي 15٪ -20٪ من جميع أورام الدماغ الأولية1. غالبا ما تتضمن استراتيجيات علاج LGGs مزيجا من الجراحة والعلاج الإشعاعي والعلاج الكيميائي ، بهدف تعظيم استئصال الورم مع الحفاظ على الوظيفة العصبية. يمكن أن تكون إدارة LGGs معقدة ، وقد يعتمد اختيار العلاج على عوامل مثل موقع الورم والخصائص الجزيئية2. أدى التقدم في فهم الأسس الجينية والجزيئية ل LGGs إلى علاجات أكثر استهدافا ، وتستمر الأبحاث الجارية لتحسين مناهج العلاج.
الورم الأرومي الدبقي ، IDH-wild type ، CNS WHO من الدرجة 4 (GBM) ، من ناحية أخرى ، هو ورم الدماغ الأولي الأكثر انتشارا الموجود لدى البالغين ، بمعدل حدوث يتراوح بين 3.19-4.17 حالة لكل 100000 شخص فيالسنة 3. يسبب GBM أعراضا مثل الصداع والنوبات والعجز العصبي البؤري والتغيرات في الشخصية وزيادة الضغط داخل الجمجمة. يتضمن العلاج القياسي ل GBM إزالة الورم ، إذا كان ذلك ممكنا ، يليه العلاج الإشعاعي جنبا إلى جنب مع Temozolomide4. علاوة على ذلك ، قد يؤدي الجمع بين تيموزولوميد ولوموستين إلى تعزيز متوسط معدل البقاء الإجمالي في المرضى الذين يعانون من مثيلة المروج O 6-methylguanine-methyltransferase (MGMT)5. ومع ذلك ، على الرغم من هذه الأساليب العلاجية الحديثة ، لا يزال GBM مرضا عضالا مع سوء التشخيص ، ويتميز بمتوسط معدل البقاء الإجمالي للمرضى من 16 شهرا إلى 20.9 شهرا عند إضافة مجالات علاج الورم (TTFields) 3,6. تم التحقيق في العديد من أساليب العلاج المناعي في GBM ولكنها أظهرت فعالية محدودة في الجسم الحي. علاوة على ذلك ، فإن القيود السريرية وما قبل السريرية تعيق الاختراقات العلاجية7. كان إنشاء نموذج مناسب وواقعي خارج الجسم الحي أمرا صعبا بسبب عدم التجانس بين 8 وداخل الورم9 ل GBM.
تمثل خطوط خلايا المريض التقليدية ثنائية الأبعاد (2D) مجموعات خلايا متجانسة وهي مناسبة لفحص الأدوية عالي الإنتاجية. ومع ذلك ، فإن خطوط الخلايا المشتقة من المريض والخالدة تفشل في تقليد GBM بشكل كاف بسبب الاختلافات في ظروف النمو والانحرافات في السمات الوراثية والنمط الظاهري بعد مقاطع متعددة10،11،12.
من ناحية أخرى ، ظهرت نماذج 3D العضوية مؤخرا كأنظمة واعدة تكرر عدم التجانس الظاهري والجزيئي للأعضاء وأنواع السرطانالمختلفة 13،14،15،16،17،18. في سياق GBM ، تم تعديل الكائنات العضوية الدماغية وراثيا لمحاكاة الخصائص الشبيهة بالورم16,17 أو استزراعها مع GSCs أو كروية للحث على تسلل الخلايا السرطانية18,19. في حين أن عضويات GBM المشتقة من المريض المزروعة باستخدام Matrigel و EGF / bFGF تظهر سمات مميزة ل GBM مثل عدم تجانس الخلايا الجذعية ونقص الأكسجة20 ، لا يزال من غير المؤكد إلى أي مدى يمكن أن يمثل هذا النموذج الخصائص الجزيئية الرئيسية لأورام المرضى.
تعد عضويات GBM المشتقة من المريض (PDOs) نماذج واعدة يمكنها الحفاظ على السمات السائدة لأورام الوالدين المماثلة ، بما في ذلك الخصائص النسيجية ، والتنوع الخلوي ، والتعبير الجيني ، والملامح الطفرية. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تسللها بسرعة عند زرعها في أدمغة القوارض البالغة ، مما يوفر نموذجا واقعيا لاختبار الأدوية والعلاج الشخصي21. ومع ذلك ، فإن تشريح أنسجة الورم يدويا لإنشاء PDOs يستغرق وقتا طويلا ومكلفا. لذلك ، توجد حاجة ملحة لطريقة سريعة يمكن أن تنتج أعدادا كبيرة من PDOs ، مما يتيح إجراء تقييم شامل للنهج العلاجية المختلفة التي تبشر بالخير لاختبار الأدوية الفردية. تصف هذه الدراسة طريقة جديدة لتصنيع PDOs مباشرة من أنسجة الورم التي تم تشريحها حديثا باستخدام مروحية الأنسجة الأوتوماتيكية. علاوة على ذلك ، تمت مقارنة PDOs الناتجة عن هذه الطريقة مع PDOs تشريح يدويا من نفس المرضى من حيث عدد PDO ، والسمات المورفولوجية ، وموت الخلايا المبرمج وتكاثر الخلايا السرطانية.
Protocol
تم علاج جميع المرضى في قسم جراحة المخ والأعصاب ، مستشفى جامعة فورتسبورغ ، ألمانيا ، بعد إعطاء موافقة خطية مستنيرة وفقا لإعلان هلسنكي وعلى النحو الذي وافق عليه مجلس المراجعة المؤسسية بجامعة فورتسبورغ (# 22/20-me). تم الحصول على مادة أنسجة الورم من أربعة مرضى GBM وورم نجمي واحد ، IDH-mutant ، مرضى CNS WHO من الدرجة 2 (الورم الدبقي منخفض الدرجة ، LGG) (الجدول 1) من الجراحة ومعالجتها باستخدام البروتوكول التالي. يشار إلى العملية الآلية لتوليد PDOs باستخدام مروحية الأنسجة باسم المروحية (C) وعملية قطع الأنسجة يدويا بمشرطين تحت التحكم المجهري كدليل (M). تم تشريح ستة أقسام متساوية الحجم (1-2 سم3) من عينة الورم ، ثم تم قطع كل قسم إلى نصفين ومعالجته بشكل متجانس باستخدام الطريقتين. بسبب عدم التجانس داخل الورم المذكور أعلاه ، تم إنشاء لوحة واحدة من 6 آبار لكل نهج من كل مريض مع كل بئر يمثل PDOs من موقع مختلف داخل الورم الأصلي. تم إجراء كلا الإجراءين تحت خزانة تدفق الهواء الصفحي وتم تعقيم جميع الأدوات المستخدمة قبل الاستخدام. ويوضح الشكل 1 نظرة عامة على هذا النهج.
1. تحضير كتل الأغاروز (لنهج C فقط ، اختياري)
- املأ 50 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) في دورق ، وأضف قرصا واحدا من الأغاروز (انظر جدول المواد) ، واخلطه جيدا حتى يتم تعليقه.
- سخني الخليط في الميكروويف لمدة 30-40 ثانية ، مع تجنب الغليان. ثم يبرد المزيج حتى يصل إلى 47 درجة مئوية.
- صب خليط الأغاروز في قالب صب محكم الغلق على شكل أسطوانة وتجنب أي تشكيل فقاعة. قم بتبريد الجبيرة على الفور باستخدام مشبك مجمد (-20 درجة مئوية) أو بوضعه على ثلج جاف لمدة 30 دقيقة.
2. معالجة مادة الورم
- قم بإعداد صندوق من الثلج للحفاظ على تبريد مادة الورم في الطريق من غرفة العمليات إلى المختبر.
- انقل نسيج الورم (4-5 سم مكعب) إلى أنبوب معقم سعة 50 مل يحتوي على 25 مل من السبات A (انظر جدول المواد) يغطي الورم وضع الأنبوب في صندوق الثلج.
- تحت خزانة تدفق الهواء الصفحي ، انقل مادة الورم مع السبات A إلى طبق بتري زجاجي معقم.
- القضاء على الأنسجة الميتة وتشريح الأوعية الدموية بعناية باستخدام مشرط وملقط الأنسجة تحت السيطرة المجهرية. حدد الأنسجة الميتة من خلال المناطق النزفية التي تظهر لونا بنيا ناتجا عن النزيف ، أو الأنسجة التي تظهر مظهرا شاحبا أو أكثر بياضا بالنسبة للأنسجة المجاورة القابلة للحياة. انتبه إلى عدم الضغط على الأنسجة أو تعطيلها.
- قطع مادة الورم إلى ست قطع بحجم تقريبي 1-2 سم3. توزيع القطع على أطباق بتري البلاستيكية (ن = 6) مملوءة مسبقا ب 3 مل من وسط H-GPSA (الجدول 2) ، كل22. ضع أطباق بتري على الجليد.
3. إعداد مفرمة الأنسجة
- ضع الشفرة كما هو موضح في دليل الشركات المصنعة23.
- اضبط سمك الشريحة على 0.45-0.50 مم. اضبط قوة الشفرة على متوسطة. قم بإصلاح مقبض تحرير الجدول إلى وضع "البدء".
4. معالجة قطع أنسجة الورم
- معالجة أنسجة الورم باستخدام المروحية (طريقة C)
- قطع كتل الأغاروز إلى أسطوانات بطول 2 سم وألصق إحدى هذه الأسطوانات على طبق بلاستيكي دائري للمروحية باستخدام غراء هيستواكريل (انظر جدول المواد).
- قم بعمل تعميق في أسطوانة الأغاروز باستخدام مشرط ، ثم قم بتركيب أنسجة الورم من البئر الأول (الخطوة 2.5) داخل هذه الحفرة.
ملاحظة: يجب التعامل مع مادة الورم بعناية وعدم ضغطها أو دفعها في الفجوة. يجب أن تكون الفجوة كبيرة بما يكفي لتناسب الورم بسهولة ، ولكنها صغيرة بما يكفي للحفاظ على استقرار مادة الورم أثناء عملية القطع. الخطوات 4.1.1. و4.1.2. اختيارية. - ضع القرص البلاستيكي على قرص التثبيت الخاص بطاولة القطع (انظر جدول المواد).
- قم بتشغيل المروحية واضغط على زر إعادة الضبط . تبدأ المروحية الآن في القطع (الجولة الأولى). تتوقف الآلة تلقائيا بعد وصول الطاولة إلى النهاية ويتم قطع كل من الأغاروز وأنسجة الورم إلى القطر المطلوب.
- قم بتدوير قرص التثبيت بمقدار 90 درجة ، ثم اضبط مقبض طاولة التحرير على وضع البدء.
- اضغط على زر إعادة الضبط واترك الجهاز يقطع الأنسجة مرة أخرى لإنشاء نسيج مستطيل الشكل (الجولة الثانية).
- قم بإزالة القرص البلاستيكي بالمواد المعالجة وقم بتدوير أنسجة الورم بعناية فقط بمقدار 90 درجة باستخدام ملعقة الأنسجة.
- ضع القرص البلاستيكي على طاولة القطع ، ثم اضبط مقبض طاولة التحرير على وضع البدء واضغط على زر إعادة الضبط لجولة القطع النهائية (الجولة الثالثة).
- أغلق المروحية وأزل القرص البلاستيكي. نظف المروحية والشفرات.
- باستخدام ماصة أحادية القناة سعة 5 مل ، قم بشفط المادة المعالجة مع الوسط في الماصة واغسل التعليق مرة أخرى في الطبق.
- كرر الخطوة السابقة 2-3 مرات لفصل الأنسجة بشكل صحيح.
- ضع طبق بتري مرة أخرى على الثلج وكرر الخطوات (4.1.1-4.1.12.) مع الأطباق الخمسة الأخرى من كل ورم.
- معالجة أنسجة الورم يدويا (طريقة M)
- انقل أنسجة الورم من طبق بتري البلاستيكي الأول (الخطوة 2.5) مع 3 مل من وسط H-GPSA (الجدول 2) إلى طبق بتري زجاجي. تشريح الجزء يدويا تحت المجهر إلى أقسام 0.5 مم باستخدام مشرطين.
- انقل الأنسجة المقطعة مرة أخرى إلى طبق بتري البلاستيكي باستخدام ماصة سعة 2 مل.
- كرر الخطوات (4.2.1.-4.2.3.) لأقسام الورم في أطباق بتري الخمسة الأخرى (الخطوة 2.5).
5. غسل أنسجة الورم
- قم بإمالة كل طبق بتري لأعلى إلى 45 درجة وانتظر لمدة 30 ثانية حتى تغرق قطع الورم في قاع الطبق.
- نضح 2.5 مل من وسط H-GPSA (الجدول 2) بعناية باستخدام ماصة 1 مل وكن على دراية بعدم تناول أي نسيج ورمي.
- أضف 2 مل من المخزن المؤقت لتحلل كرات الدم الحمراء (انظر جدول المواد) لكل عينة. يجب تغطية قطع الورم المعالجة بالكامل بواسطة محلول التحلل.
- ضع 6 أطباق على آلة الاهتزاز المداري المختبرية على سرعة بطيئة لمدة 10 دقائق.
- نضح 2 مل من المخزن المؤقت للتحلل بعناية حتى لا تأخذ أي نسيج ورمي.
- كرر خطوات الغسيل السابقة (الخطوة 5.1-5.5) مرتين باستخدام 2 مل من وسط H-GPSA (الجدول 2) بدلا من محلول التحلل في كل مرة.
6. زراعة أنسجة الورم
- نضح وسط H-GPSA (الجدول 2) من كل طبق واستبدله ب 4 مل من وسط PDO (الجدول 2).
- انقل قطع الأنسجة من كل طبق إلى بئر واحد من لوحة ذات 6 آبار منخفضة للغاية (انظر جدول المواد).
- ضع اللوحة على شاكر مداري داخل حاضنة واحتضانها عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 و 150 دورة في الدقيقة لمدة 2-4 أسابيع.
- قم بإجراء تغيير نصف متوسط كل يومين عن طريق شفط 2 مل من الوسط من كل بئر واستبداله ب 2 مل من وسط PDO الطازج (الجدول 2) تم تسخينه مسبقا إلى 37 درجة مئوية.
- راقب الأنسجة تحت المجهر (التشكل ، النمو ، اللون المتوسط) وقم بقطع PDOs المتنامية (>0.7 مم) أو الأنسجة اللاصقة لمنع نقص الأكسجة في الأنسجة.
- للقيام بذلك ، انقل PDOs من المرفق المنخفض للغاية جيدا إلى طبق بتري زجاجي معقم واستخدم مشرطا للتقطيع. بدلا من ذلك ، يمكن حل PDOs اللاصقة عن طريق استنشاقها باستخدام ماصة 1 مل. احرص على عدم الضغط على PDOs والتعامل معها بلطف.
- قم بتقييم تكوين PDO عن طريق حساب PDO كل يومين وتحقق بدقة من التشكل الدائري المطلوب (الشكل 2).
7. إصلاح وتضمين PDOs
- إصلاح اثنين من PDOs من كل بئر من كل مريض مع 4 ٪ الفورمالين لمدة 24 ساعة بعد 6 أسابيع من الثقافة.
- اغمر PDOs الثابتة في الفورمالين المخزن بشكل محايد (فوسفات الصوديوم) حتى التضمين.
- ضع كل PDO في شريط (انظر جدول المواد) لمزيد من المعالجة.
- ابدأ عملية التجفيف عن طريق غمر الكاسيت في المحاليل التالية كما هو مذكور في الملاحظة أدناه:
ملاحظة: 50٪ إيثانول لمدة 20 دقيقة ، 70٪ إيثانول لمدة 20 دقيقة ، 80٪ إيثانول لمدة 20 دقيقة ، 96٪ إيثانول لمدة 20 دقيقة ، 100٪ إيثانول لمدة 20 دقيقة ، 100٪ إيثانول لمدة 30 دقيقة ، 100٪ إيثانول + كلوروفورم (نسبة 1: 1) لمدة 30 دقيقة ، 100٪ إيثانول + كلوروفورم (نسبة 1: 1) لمدة 30 دقيقة ، الكلوروفورم المطلق لمدة 30 دقيقة ، الكلوروفورم المطلق لمدة 30 دقيقة ، البارافين لمدة 30 دقيقة ، البارافين لمدة 30 دقيقة باستخدام STP 120. - قم بتضمين PDOs المجففة في شمع البارافين عند 58-60 درجة مئوية.
- قم بتقطيع PDOs المضمنة بسمك 2.5 ميكرومتر وقم بتركيبها على شرائح للتلطيخ.
8. تلطيخ المناعي
- قم بتركيب PDOs بعد 6 أسابيع من الثقافة.
- بعد ذلك ، قم بإجراء تلطيخ مزدوج ضد البروتين الحمضي الليفي الدبقي (GFAP ، التخفيف: 1: 100) وعلامة الانتشار Ki67 (التخفيف: 1: 1000) (انظر جدول المواد) ، كما ورد سابقا22.
- وبالمثل ، قم بتقييم موت الخلايا المبرمج عن طريق تلطيخ PDOs المزدوج ضد GFAP ومضاد caspase-3 (CC3 ، التخفيف: 1: 400) (انظر جدول المواد).
- التقط صورا لأجهزة PDO باستخدام مجهر مضان بتكبير 40x.
- قم بتحليل الصور بحثا عن الخلايا الإيجابية GFAP و Ki67 و CC3 ، بالإضافة إلى الخلايا الإيجابية المزدوجة GFAP / Ki67 و GFAP / CC3.
- استخدم برنامج فيجي مفتوح المصدر (ImageJ-win 32) لتحليل الصور.
9. التقييم وتحليل البيانات
- التقط صورا ميدانية ساطعة مجهرية يومية خلال الأسبوع الأول من الثقافة بالإعدادات القياسية وتكبير 5x.
- مراقبة التغيرات المورفولوجية وتتبع عملية النضج في كل من مناهج المعالجة اليدوية والآلية.
- إجراء التحليل المورفولوجي باستخدام المجهر في إعدادات وضع برايتفيلد القياسية.
- تقييم عدد PDO والتشكل خلال أول 4 أسابيع من الثقافة في PDOs من جميع المرضى الخمسة.
- احصل على ثلاث قراءات لكل عدد من أعداد PDO من كل مريض لحساب المتوسط والخطأ المعياري للمتوسط (SEM).
- التحقيق في الانتشار وموت الخلايا المبرمج في PDOs من ثلاثة مرضى.
- تحليل البيانات باستخدام حزمة برامج إحصائية متاحة تجاريا (انظر جدول المواد).
- قم بتطبيق اختبارات Students-T و Mann-Whitney U لتحديد الاختلافات بين توليد PDO اليدوي والآلي من حيث عدد PDO والانتشار وموت الخلايا المبرمج.
Representative Results
تم تضمين أربعة مرضى يعانون من GBM وواحد مع LGG بعد التأكيد المرضي من قبل طبيب أعصاب ذي خبرة (CMM). كان لدى غالبية المرضى محفز MGMT غير ميثيل ، وكان جميع مرضى GBM من النوع البري IDH1 و IDH2 (الجدول 1). في المتوسط ، استغرقت عملية التصنيع 88.8 دقيقة (+/- 6.3 دقيقة) في النهج C و 322 دقيقة (+/- 17.2 دقيقة) في نهج M. كان معدل النجاح الإجمالي 87٪ في الدليل و 93٪ في نهج المروحية بعد 4 أسابيع من الثقافة (ن = 5). علاوة على ذلك ، وصلت PDOs المشتقة من المجموعة C إلى الشكل المستدير المطلوب في غضون أسبوع واحد وكانت ناضجة بما يكفي لاستخدامها في التجارب المختبرية ، في حين ظلت PDOs للمجموعة M في الغالب ذات حواف حادة وغير محددة (الشكل 2). نتج عن أنسجة الورم التي تمت معالجتها باستخدام نهج C إجمالي 281 PDOs (المتوسط لكل مريض = 56 +/- 43) بعد الأسبوع الأول من الثقافة ، بينما تم تطوير 250 PDOs (المتوسط لكل مريض = 50 +/- 41) باستخدام نهج M. خلال الأسبوع الثاني من المزرعة ، أسفرت أنسجة جميع المرضى الخمسة عن أعداد أعلى من PDO عندما تم إنشاؤها باستخدام نهج C (801; المتوسط لكل مريض = 130 +/- 38) مقارنة بنهج M (601; المتوسط لكل مريض = 76 +/- 44 ؛ ف = 0.018). خلال الأسبوع الثالث من المزرعة ، جمع نهج C إجمالي 1105 PDOs من جميع المرضى (المتوسط لكل مريض = 221 +/- 32) مقارنة ب 771 PDOs (المتوسط لكل مريض = 155 +/- 34) في نهج M (P = 0.032). علاوة على ذلك ، تم تشكيل ما مجموعه 1195 PDOs (المتوسط لكل مريض = 239 +/- 50) بعد أربعة أسابيع من الثقافة عند توليدها باستخدام نهج C مقارنة ب 784 (المتوسط لكل مريض = 157 +/- 36) باستخدام نهج M (P < 0.01). لذلك ، أظهرت طريقة C عددا أعلى بكثير من PDOs بدءا من الأسبوع الثاني (الشكل 3). علاوة على ذلك، تم تقييم التقلبات النسبية في أعداد شركات تنمية نفط عمان لاستكشاف الاتجاهات الديناميكية بين الأسابيع المتعاقبة. وكشف التحليل النقاب عن زيادة مثيرة للإعجاب في أعداد شركات تنمية نفط عمان خلال الانتقال الأولي من الأسبوع الأول إلى الأسبوع الثاني في نهج C (265٪)، مما يدل على التقدم السريع. بعد ذلك ، كان هناك ارتفاع أقل في العد خلال الأسبوع الثالث (75٪) ، مما يعكس تعديلا مؤقتا. في المقابل، أظهر نهج M زيادة ثابتة ومطردة في أعداد شركات تنمية نفط عمان (92٪ في الأسبوع الثاني، و 67٪ على التوالي في الأسبوع الثالث)، مما ساهم في استقرار ملحوظ في العد خلال الأسبوع الرابع. ويؤكد هذا الاتجاه التصاعدي المستمر في أعداد شركات تنمية نفط عمان على موثوقية ومرونة النهج C طوال فترة المراقبة.
تم تضمين اثنين من مرضى GBM ومريض LGG واحد لتحليل أعداد الخلايا النجمية (GFAP) داخل PDOs ، وتكاثر خلايا PDO (Ki67) ، وموت الخلايا المبرمج (CC3). كشف عدد الخلايا النجمية المحدد عن عدم وجود فروق ذات دلالة إحصائية بين طريقتي المعالجة بمتوسط 43٪ في النهج C و 45٪ في النهج M (الشكل 4 والشكل 5 ، الشكل التكميلي 1 والشكل التكميلي 2). وبالمثل ، كانت معدلات الانتشار داخل PDOs قابلة للمقارنة بين النهج C (3٪) و M (1٪). فقط PDOs التي تم إنشاؤها باستخدام نهج C من المريض 5 أظهرت معدل انتشار بنسبة 26٪ مقارنة ب 1٪ مع نهج M (P = 0.001; الشكل 4C). تم الكشف عن معدلات موت الخلايا المبرمج المنخفضة بشكل عام في PDOs التي تمت معالجتها باستخدام نهج C (3٪) مقارنة ب 2٪ من نهج M لجميع المرضى ، والتي لم تكن مختلفة بشكل كبير (الشكل 5C). علاوة على ذلك ، لم يكن هناك فرق كبير بين الطريقتين فيما يتعلق بعدد الخلايا النجمية التي تخضع لموت الخلايا المبرمج (الشكل 5D).
الشكل 1: نظرة عامة رسومية لعملية تصنيع العضو العضوي المشتق من المريض (PDO) باستخدام المروحية الآلية مقابل النهج اليدوي. يصور الرسم التوضيحي الخطوات المختلفة المعنية ، بما في ذلك (أ) جمع العينات ، (ب) تشريح مادة الورم ، (ج) الغسيل ، (د) الحضانة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: مورفولوجيا شركة تنمية نفط عمان خلال الأسبوع الأول من الثقافة. مقارنة بين تشريح ما بعد تشكيل PDOs باستخدام كل من المروحية الآلية والطريقة اليدوية. قضبان المقياس = 1000 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: إحصاء شركة تنمية نفط عمان خلال الأسابيع الأربعة الأولى من الثقافة. يعرض المحور السيني الوقت بالأسابيع (W) ، والمحور ص عدد PDOs لنهج C (أزرق) و M (أحمر) (n = 5). تمثل كل نقطة بيانات متوسط العدد ، مع أشرطة خطأ تشير إلى الخطأ القياسي للمتوسط. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: معدلات تكاثر الخلايا داخل PDOs. (أ) صور التألق المناعي التمثيلي (ن = 3) للخلايا الإيجابية GFAP (الأخضر) ، والخلايا الإيجابية Ki67 (الحمراء) ، و DAPI (الأزرق) في PDOs من المرضى 3 و 4 و 5 (الجدول 1). تمت معالجة جميع PDOs باستخدام طريقة المروحية (C) واليدوية (M). أشرطة المقياس = 100 ميكرومتر. (ب) مقارنة بين الطريقتين فيما يتعلق بالعدد النسبي للخلايا الموجبة ل GFAP ، (ج) الخلايا الموجبة Ki67 ، و (د) الخلايا الموجبة المزدوجة Ki67 / GFAP. لا يشار إلى نتائج مهمة بواسطة "ns". يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: معدلات موت الخلايا المبرمج داخل PDOs. (أ) صور التألق المناعي التمثيلي (ن = 3) للخلايا الإيجابية GFAP (الأخضر) ، والخلايا الإيجابية CC3 (الحمراء) ، و DAPI (الأزرق) في PDOs من المرضى 3 و 4 و 5 (الجدول 1). تمت معالجة جميع PDOs باستخدام طريقة المروحية (C) واليدوية (M). قضبان المقياس = 100 ميكرومتر. (ب) مقارنة بين الطريقتين فيما يتعلق بالعدد النسبي للخلايا الموجبة ل GFAP ، (C) الخلايا الموجبة CC3 ، و (د) الخلايا الموجبة المزدوجة CC3 / GFAP. لا يشار إلى نتائج مهمة بواسطة "ns". يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الجدول 1: خصائص المرضى والمعلمات السريرية. GBM = ورم أرومي دبقي ، نوع IDH البري ، الجهاز العصبي المركزي WHO الصف 4 ؛ LGG = ورم دبقي منخفض الدرجة ؛ KPS = درجة أداء كارنوفسكي ؛ MGMT = O 6-ميثيل جوانين-DNA ميثيل ترانسفيراز ؛ IDH1 = إيزوسيترات ديهيدروجيناز 1 ، IDH2 = إيزوسيترات ديهيدروجيناز 2 ، ATRX = α-ثلاسيميا / تخلف عقلي ، جين مرتبط ب X ؛ م = مورفولوجيا ؛ CC = عدد الخلايا ؛ ع = الانتشار ؛ أ = موت الخلايا المبرمج. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.
الجدول 2: التراكيب المتوسطة. H-GPSA = السبات A-Glutamax pencillin streptomycin amphotericin B. PDO = المواد العضوية المشتقة من المريض DMEM: وسط النسر المعدل من Dulbecco. NEAA: الأحماض الأمينية غير الأساسية. بكتيريا القلم: البنسلين / الستربتومايسين الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.
الجدول 3: نظرة عامة على التقنيات المستخدمة لتوليد نماذج زراعة الخلايا. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.
الشكل التكميلي 1: القنوات الفردية لتلطيخ انتشار PDOs. (أ) DAPI (أزرق) ، (ب) خلايا إيجابية GFAP (خضراء) ، (ج) خلايا موجبة Ki67 (حمراء) و (د) قناة تراكب في PDOs من المرضى 3 و 4 و 5. قضبان المقياس = 100 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
الشكل التكميلي 2: القنوات الفردية لتلطيخ موت الخلايا المبرمج ل PDOs. (أ) DAPI (أزرق) ، (ب) خلايا إيجابية GFAP (أخضر) ، (ج) خلايا إيجابية CC3 (حمراء) و (د) قناة تراكب في PDOs من المرضى 3 و 4 و 5. قضبان المقياس = 100 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
Discussion
تقدم هذه الدراسة طريقة سريعة وفعالة لإنشاء PDOs. لا يزال GBM ورما صعبا للعلاج ، وغالبا ما يتميز بالانتكاس وعبء المرض المرتفع 3,6. هناك حاجة ماسة إلى نهج علاجية مبتكرة ، لأن النتائج الواعدة التي لوحظت في المختبر غالبا ما تفشل في إثبات فعاليتها في الجسم الحي أثناء تجارب المرحلة الأولى. قد يكون أحد أسباب هذا التناقض هو القدرة المحدودة لخطوط الخلايا الخالدة المشتقة من المريض ، والتي نمت في مزارع أحادية الطبقة ، لتعكس التفاعلات المعقدة بين الخلايا والخلايا والخصائص الوراثية للورم الأبوي. نظرا لعدم التجانس العالي بين الأورام وداخلها ل GBM 8,9 ، فإن العلاجات المستهدفة الشخصية مفضلة وقد تبشر بالخير للتطبيقات المستقبلية. على عكس خطوط الخلايا الملتصقة 2D ، تتمتع الكائنات العضوية بالقدرة على الاحتفاظ بخصائص الأنسجة الأبوية21 ، ومع ذلك فإن تفاعلات الخلايا الخلوية المعقدة بين الورم والدماغ الطبيعي لها أهمية قصوى ويمكن تجاهلها بواسطة هذا النموذج. ومع ذلك ، فإن التوليد اليدوي ل PDOs هو عملية تستغرق وقتا طويلا ، ويمكن أن يؤدي تلف الأنسجة الناجم عن الضغط بالمشارط أثناء القطع إلى إعاقة نمو PDO الناجح. لذلك ، تم تحسين طريقة آلية باستخدام مفرمة الأنسجة لتوليد أعداد أكبر من PDOs مع تقليل الوقت والجهد. بالإضافة إلى ذلك ، أثبتنا أن معدلات الانتشار وموت الخلايا المبرمج الإجمالية لم تختلف بين النهجين.
نهج C واضح ومباشر وسهل التنفيذ ويتيح إنشاء عدد أكبر من PDOs (الشكل 3). تم تحديد دوران الأنسجة بين الجولتين الثانية والثالثة من التقطيع كخطوة حاسمة في البروتوكول. في هذه المرحلة ، فقدت الأنسجة بالفعل سلامتها ويمكن أن تنهار بسهولة ، مما يؤدي إلى قطع أكبر تتطلب قطعا إضافيا أو تشريحا يدويا تحت المجهر. في حين أن نهج المروحية الآلية يسمح بحجم قطع محدد مسبقا بدقة أكبر ، فإن النهج اليدوي يفتقر إلى الدقة في تحديد حجم PDOs ، مما يؤدي إلى PDOs غير متساوية الشكل والحجم ، وهو عيب لفحص الأدوية المقارن (الشكل 2). ومع ذلك ، مع الطريقة المقترحة ، لم يتم تحقيق توحيد أرقام الخلايا لكل شركة تنمية نفط عمان ، مما قد يشكل عائقا لبروتوكولات فحص الأدوية الموحدة. مزايا وعيوب تقنيات توليد العضوية المختلفة18،19،20،24،25،26،27،28،29،30،31،32،33،34،35،36 ،
37،38،39،40،41،42 وتطبيقاتها ملخصة في الجدول 3.
يمكن أن تختلف أنسجة GBM في الاتساق ، بدءا من صلبة (منطقة التسلل) إلى لينة (قلب نخرية) ، والتي يمكن أن تشكل تحديات لنهج المروحية الآلية. إذا كان النسيج شديد الصلابة ، فقد تضغط عليه المروحية وتتلفه ، بينما قد يتم سحق الأنسجة الرخوة جدا. أظهر النسيج المختار سمات مميزة ، بما في ذلك مستوى متوسط من الصلابة ، يتميز بشكل متقطع بلون رمادي وردي بدلا من إظهار اللون البني أو الأصفر. أظهرت الأنسجة التي تمتلك نسيجا إسفنجيا ومتفتتا بسهولة حفظا فائقا داخل كتل الأغاروز ، في حين تم حذف أنسجة الورم الحساسة للغاية والمسيلة من إجراء أخذ العينات. ومع ذلك ، مكن نهج المروحية من توليد ناجح لعدد أكبر من PDOs مقارنة بالنهج اليدوي ، حتى مع وجود أنسجة ذات اتساق دون المستوى الأمثل. الحل الرئيسي هو الحفاظ على تفاعل وثيق مع الجراح الذي يقوم باستئصال الورم لمعالجة الأنسجة من مناطق مختلفة من الورم. في حالات تناسق الأنسجة دون المستوى الأمثل ، كانت إعادة صياغة الأنسجة يدويا تحت المجهر إضافة مفيدة بعد التقطيع. لحساب عدم التجانس ، تم تقسيم أنسجة الورم في البداية إلى ستة أجزاء ، تم تقسيم كل منها لاحقا إلى النصف إما لنهج C أو M. ضمن هذه الأقسام الستة المتميزة ، من المتوقع وجود درجة كبيرة من عدم التجانس. علاوة على ذلك ، حتى داخل PDOs من نفس القسم أو البئر ، فإن وجود مجموعات فرعية متميزة أمر معقول.
كدليل على المفهوم ، تم الإبلاغ عن بيانات الانتشار وموت الخلايا المبرمج من مريضين مصابين ب GBM ومريض واحد مصاب ب LG ، والتي لا تظهر فروقا ذات دلالة إحصائية بين الطريقتين. لا يقتصر توليد PDOs على أورام الدماغ الخبيثة للغاية ولكن يمكن أيضا تطبيقه على LGGs. تسلط هذه الدراسة الضوء على أن LGG نادرا ما تظهر نموا في ثقافة 2D ، مما يجعل تطوير نموذج دقيق لدراستهم ذا قيمة عالية. يهدف هذا البروتوكول إلى إظهار براعة هذا النهج في إنشاء PDOs من GBM وكذلك LGG بسرعة وفعالية.
بشكل عام ، يمكن استخدام PDOs في المستقبل لإجراء اختبار ما قبل العلاج الموجه للمريض للعلاجات المستهدفة في أورام الدماغ الخبيثة. يعد توفير طريقة سريعة وفعالة لفحص الأدوية الفردية أمرا بالغ الأهمية ، حيث يحدث تطور الورم بسرعة ، وهناك حاجة ماسة إلى خيارات علاج الإنقاذ. وكخطوة تالية، يمكن تقييم نموذج شركة تنمية نفط عمان من خلال مناهج علاجية مناعية مختلفة لمحاكاة استجابات العلاج الحقيقية بشكل أفضل. في المستقبل ، يمكن استخدام PDOs لاستخلاص استنتاجات معقدة فيما يتعلق بالحاجة إلى مزيد من الاستكشاف وتقييم العلاجات في بيئة سريرية.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
تم تمويل هذا البحث من قبل المركز متعدد التخصصات للبحوث السريرية (IZKF ، B-450) فورتسبورغ ، المركز البافاري لأبحاث السرطان (BZKF) والمنشور المدعوم من صندوق النشر المفتوح التابع لجامعة فورتسبورغ. نود أن نشكر داغمار هيمريش وسيغليند كونيل ، كلاهما قسم جراحة الأعصاب التجريبية ، قسم جراحة المخ والأعصاب ، مستشفى جامعة فورتسبورغ ، على الدعم الفني. تم إنشاء الشكل 1 باستخدام www.biorender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-mercaptoethanol (1000x) | Gibco | 21985023 | |
| 30% formaldehyde methanol-free | Carl Roth | 4235.1 | Used in 4% concentration |
| 70% ethanol solution | For sterilisation | ||
| Agarose tablets 0.5 g | Carl Roth | HP67.7 | |
| Amphotericin B 250 µg/mL | Gibco | 15290018 | |
| Anatomical forceps | Hartstein | N/A | |
| Anatomical spatula | Hartstein | N/A | |
| B-27 Supplement without vitamin A (50x) | Gibco | 12587010 | |
| Biopsy cassette with cover | Resolab | 37001-b | |
| Blades for McIlwain Tissue Chopper | Campden instruments | Model TC752-1 | |
| CC3 antibody (Asp 175) | Cells signaling technology | 9661 | |
| Disposable scalpel | Feather | 0200130015 | |
| Distilled water | Gibco | 15230089 | To dilute the formaldehyd |
| Dulbecco's Modified Eagle Serum Nutrient Mixture (DMEM) F-12 (1:1) (1x) | Gibco | 11330032 | Includes L-Glutamine and 15 mM HEPES |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma Life Sciences | D8537-500ML | Modified, without calcium, chloride and magnesium chloride, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture |
| eBioscience 1x RBC Lysis Buffer | Invitrogen | 433357 | |
| Falcon tube 50 ml Cellstar | Greiner Bio-One | 227261 | |
| GFAP antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc33673 | |
| Glass beaker | N/A | N/A | |
| Glass petri dish | N/A | N/A | |
| GlutaMAX (100x) | Gibco | 35050061 | |
| Heracell 240i CO2 Incubator | Thermo scientific | 51032875 | |
| Herasafe 2025 Biological Safety Cabinet | Thermo scientific | 5016643 | |
| Hibernate-A | Gibco | A1247501 | |
| Histoacryl glue | B. Braun surgical | 1050052 | |
| Human Insulin, Solution | Santa Cruz Biotechnology | sc-360248 | |
| Ice box | N/A | N/A | |
| Ki67 antibody | Abcam | ab16667 | |
| McIlwain Tissue Chopper | Cavey Laboratory Engineering | 51350V | |
| Microscope Leica DMI 3000B, DMI 4000B, DMI 6000B | Leica | DMI6000B | For brightfield and immunofluorescence pictures |
| Microscope stereozoom S9D | Leica | W841832 | For manual cutting and to organoids monitoring |
| Microwave | Bosch | N/A | To heat the agarose solution |
| Mounting plastic discs | Cavey Laboratory Engineering | 51354 | |
| N-2 Supplement (100x) | Gibco | 17502048 | |
| NEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) (100x) | Gibco | 11140050 | |
| Neurobasal (1x) | Gibco | 21103049 | |
| Orbital shaking machine Rotamax120 | Heidolph | 10304491 | |
| Penicilin Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Plastic petri dishes Cellstar | greiner bio-one | 628160 | n = 12 |
| Single channel pipette 1000 µm | Eppendorf | 4924000010 | |
| Single channel pipette 5000 µm | Eppendorf | EP3123000276 | |
| Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) version 23.0 | IBM | ||
| Surgipath Paraplast | Leica | 39601006 | Embedding medium |
| Ultra-low attachment Nucleon Sphera 6-well plate | Thermo Scientific | 174932 |
References
- Gatto, L., et al. IDH inhibitors and beyond: the cornerstone targeted glioma treatment. Mol Diagn Ther. 25 (4), 457-473 (2021).
- Buckner, J. C., et al. Radiation plus Procarbazine, CCNU, and Vincristine in low-grade glioma. N Engl J Med. 374 (14), 1344-1355 (2016).
- Grochans, S., et al.
- Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma). N Engl J Med. 352 (10), 987-996 (2005).
- Herrlinger, U., et al. Lomustine-temozolomide combination therapy versus standard temozolomide therapy in patients with newly diagnosed glioblastoma with methylated MGMT promoter (CeTeG/NOA-09): a randomised, open-label, phase 3 trial. Lancet. 393 (10172), 678-688 (2019).
- Stupp, R., et al. Effect of tumor-treating fields plus maintenance temozolomide vs maintenance temozolomide alone on survival in patients with glioblastoma: a randomized clinical trial. Jama. 318 (23), 2306-2316 (2017).
- Desbaillets, N., Hottinger, A. F. Immunotherapy in glioblastoma: a clinical perspective. Cancers (Basel). 13 (15), 3721 (2021).
- Gularyan, S. K., et al. Investigation of inter- and intratumoral heterogeneity of glioblastoma using TOF-SIMS). Mol Cell Proteomics. 19 (6), 960-970 (2020).
- Brennan, C. W., et al. The somatic genomic landscape of glioblastoma. Cell. 155 (2), 462-477 (2013).
- Lathia, J. D., Mack, S. C., Mulkearns-Hubert, E. E., Valentim, C. L., Rich, J. N.
- Pollard, S. M., et al. Glioma stem cell lines expanded in adherent culture have tumor-specific phenotypes and are suitable for chemical and genetic screens. Cell Stem Cell. 4 (6), 568-580 (2009).
- Timerman, D., Yeung, C. M. Identity confusion of glioma cell lines. Gene. 536 (1), 221-222 (2014).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Kopper, O., et al. An organoid platform for ovarian cancer captures intra- and interpatient heterogeneity. Nat Med. 25 (5), 838-849 (2019).
- Lee, S. H., et al. Tumor evolution and drug response in patient-derived organoid models of bladder cancer. Cell. 173 (2), 515-528 (2018).
- Bian, S., et al. Genetically engineered cerebral organoids model brain tumor formation. Nat Methods. 15 (8), 631-639 (2018).
- Ogawa, J., Pao, G. M., Shokhirev, M. N., Verma, I. M. Glioblastoma model using human cerebral organoids. Cell Rep. 23 (4), 1220-1229 (2018).
- Linkous, A., et al. Modeling patient-derived glioblastoma with cerebral organoids. Cell Rep. 26 (12), 3203-3211 (2019).
- da Silva, B., Mathew, R. K., Polson, E. S., Williams, J., Wurdak, H. Spontaneous glioblastoma spheroid infiltration of early-stage cerebral organoids models brain tumor invasion. SLAS Discov. 23 (8), 862-868 (2018).
- Hubert, C. G., et al. A three-dimensional organoid culture system derived from human glioblastomas recapitulates the hypoxic gradients and cancer stem cell heterogeneity of tumors found in vivo. Cancer Res. 76 (8), 2465-2477 (2016).
- Jacob, F., et al. A patient-derived glioblastoma organoid model and biobank recapitulates inter- and intra-tumoral heterogeneity. Cell. 180 (1), 188-204 (2020).
- Nickl, V., et al. Glioblastoma-derived three-dimensional ex vivo models to evaluate effects and efficacy of tumor treating fields (TTFields). Cancers (Basel). 14 (21), 5177 (2022).
- Tissue Chopper. Lafayette Instrument. , Available from: http://lafayetteinstrument.com (2023).
- Klein, E., Hau, A. C., Oudin, A., Golebiewska, A., Niclou, S. P. Glioblastoma organoids: pre-clinical applications and challenges in the context of immunotherapy. Front Oncol. 10, 604121 (2020).
- Golebiewska, A., et al. Patient-derived organoids and orthotopic xenografts of primary and recurrent gliomas represent relevant patient avatars for precision oncology. Acta Neuropathol. 140 (6), 919-949 (2020).
- Bougnaud, S., et al. Molecular crosstalk between tumour and brain parenchyma instructs histopathological features in glioblastoma. Oncotarget. 7 (22), 31955-31971 (2016).
- Chua, C. W., et al. Single luminal epithelial progenitors can generate prostate organoids in culture. Nat Cell Biol. 16 (10), 951-954 (2014).
- Collingridge, G. L. The brain slice preparation: a tribute to the pioneer Henry McIlwain. J Neurosci Methods. 59 (1), 5-9 (1995).
- Kato, H., Ogawa, T. A technique for preparing in vitro slices of cat's visual cortex for electrophysiological experiments. J Neurosci Methods. 4 (1), 33-38 (1981).
- Teyler, T. J.
- Schulz, E., et al. Preparation and culture of organotypic hippocampal slices for the analysis of brain metastasis and primary brain tumor growth. Methods Mol Biol. 2294, 59-77 (2021).
- Driehuis, E., Gracanin, A., Vries, R. G. J., Clevers, H., Boj, S. F. Establishment of pancreatic organoids from normal tissue and tumors. STAR Protoc. 1 (3), 100192 (2020).
- Driehuis, E., et al. Pancreatic cancer organoids recapitulate disease and allow personalized drug screening. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (52), 26580-26590 (2019).
- Neal, J. T., et al. Organoid modeling of the tumor immune microenvironment. Cell. 175 (7), 1972-1988 (2018).
- Li, X., et al. Oncogenic transformation of diverse gastrointestinal tissues in primary organoid culture. Nat Med. 20 (7), 769-777 (2014).
- Ootani, A., et al. Sustained in vitro intestinal epithelial culture within a Wnt-dependent stem cell niche. Nat Med. 15 (6), 701-706 (2009).
- Zhao, Z., et al.
- Toh, Y. C., et al. A novel 3D mammalian cell perfusion-culture system in microfluidic channels. Lab Chip. 7 (3), 302-309 (2007).
- Zhang, C., Zhao, Z., Abdul Rahim, N. A., van Noort, D., Yu, H. Towards a human-on-chip: culturing multiple cell types on a chip with compartmentalized microenvironments. Lab Chip. 9 (22), 3185-3192 (2009).
- Homan, K. A., et al. Flow-enhanced vascularization and maturation of kidney organoids in vitro. Nat Methods. 16 (3), 255-262 (2019).
- Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
- Kengla, C., Atala, A., Sang Jin, L.
