Trapianto tracheale intrapolmonare murino: un modello per lo studio della malattia obliterante delle vie aeree dopo il trapianto di polmone
Summary
Il modello murino di trapianto tracheale intrapolmonare (IPTT) è utile per lo studio della malattia obliterante delle vie aeree (OAD) dopo il trapianto di polmone. Offre approfondimenti sul comportamento immunologico e angiogenico polmonare specifico nell’obliterazione delle vie aeree dopo allotrapianto con elevata riproducibilità. Qui descriviamo la procedura IPTT e i suoi risultati attesi.
Abstract
Il trapianto tracheale intrapolmonare murino (IPTT) viene utilizzato come modello di malattia obliterante delle vie aeree (OAD) dopo trapianto di polmone. Inizialmente riportato dal nostro team, questo modello è stato utilizzato nello studio dell’OAD grazie alla sua elevata riproducibilità tecnica e all’idoneità per lo studio di comportamenti immunologici e interventi terapeutici.
Nel modello IPTT, un innesto tracheale di roditore viene inserito direttamente nel polmone del ricevente attraverso la pleura. Questo modello è distinto dal modello di trapianto tracheale eterotopico (HTT), in cui gli innesti vengono trapiantati in siti sottocutanei o omentali, e dal modello di trapianto tracheale ortotopico (OTT) in cui la trachea del donatore sostituisce la trachea del ricevente.
L’implementazione di successo del modello IPTT richiede competenze anestesiologiche e chirurgiche avanzate. Le abilità anestetiche includono l’intubazione endotracheale del ricevente, l’impostazione di parametri ventilatori appropriati e l’estubazione opportunamente programmata dopo il recupero dall’anestesia. Le competenze chirurgiche sono essenziali per il posizionamento preciso dell’innesto all’interno del polmone e per garantire un’efficace sigillatura della pleura viscerale per prevenire perdite d’aria e sanguinamento. In generale, il processo di apprendimento dura circa 2 mesi.
A differenza dei modelli HTT e OTT, nel modello IPTT, le vie aeree allotrapianto sviluppano l’obliterazione delle vie aeree nel microambiente polmonare pertinente. Ciò consente ai ricercatori di studiare i processi immunologici e angiogenici specifici del polmone coinvolti nell’obliterazione delle vie aeree dopo il trapianto di polmone. Inoltre, questo modello è anche unico in quanto presenta organi linfoidi terziari (TLO), che si osservano anche negli allotrapianti polmonari umani. I TLO sono costituiti da popolazioni di cellule T e B e caratterizzati dalla presenza di venule endoteliali elevate che dirigono il reclutamento delle cellule immunitarie; pertanto, è probabile che svolgano un ruolo cruciale nell’accettazione e nel rigetto del trapianto. Concludiamo che il modello IPTT è uno strumento utile per studiare le vie immunitarie e profibrotiche intrapolmonari coinvolte nello sviluppo dell’obliterazione delle vie aeree nell’alloinnesto del trapianto di polmone.
Introduction
Il trapianto di polmone è stato stabilito come trattamento efficace per i pazienti con malattie respiratorie allo stadio terminale. Tuttavia, il tasso mediano di sopravvivenza per i pazienti sottoposti a trapianto di polmone umano è solo di circa 6 anni, con lo sviluppo di bronchiolite obliterante (OB), un tipo di malattia ostruttiva delle vie aeree (OAD), che è una delle principali cause di morte dopo il primo anno dopo il trapianto.
Diversi modelli animali sono stati utilizzati per studiare il meccanismo alla base dell’OAD. Uno di questi modelli è il trapianto tracheale eterotopico (HTT) modello2. In questo modello, gli innesti tracheali vengono impiantati nel tessuto sottocutaneo o nell’omento del ricevente. Si verifica la perdita indotta da ischemia delle cellule epiteliali dell’innesto tracheale, seguita da infiltrazione linfocitaria alloreattiva e apoptosi delle cellule epiteliali del donatore. I fibroblasti e i miofibroblasti migrano intorno alla trachea, producendo una matrice extracellulare. Infine, si verifica la completa obliterazione fibrosa del lume delle vie aeree. Il modello HTT è tecnicamente semplice, fornisce un ambiente in vivo e offre un’elevata riproducibilità.
Un altro modello per lo studio dell’OAD è il modello di trapianto tracheale ortotopico (OTT) di ratto, in cui gli innesti tracheali vengono interposti nella trachea del ricevente per mantenere la ventilazione fisiologica3. In questo modello, la deplezione indotta dall’ischemia delle cellule epiteliali del donatore provoca la loro sostituzione con cellule epiteliali riceventi all’interno della trachea, formando una via aerea non ostruita accompagnata da una moderata fibrosi. Sebbene questi modelli abbiano contribuito alla comprensione dell’obliterazione delle vie aeree dopo il trapianto di polmone, presentano limitazioni in termini di ricapitolazione del microambiente parenchimale polmonare.
Il nostro gruppo di ricerca ha introdotto il modello di trapianto tracheale intrapolmonare di ratto (IPTT), in cui gli innesti tracheali vengono impiantati nel polmone ricevente4 (Figura 1). Il modello IPTT mostra l’obliterazione fibrosa del lume delle vie aeree che si verifica all’interno del microambiente polmonare. Inoltre, è stato applicato con successo a topi che sono tecnicamente più impegnativi del ratto IPTT 5,6,7,8,9,10. Questo adattamento del modello IPTT murino ci ha permesso di approfondire gli intricati dettagli dell’ambiente immunologico polmonare dell’OAD dopo il trapianto di polmone utilizzando topi transgenici.
Il modello IPTT possiede alcune caratteristiche uniche. Uno è la neoangiogenesi, che è facilitata dalla circolazione polmonare e svolge un ruolo cruciale nell’obliterazione delle vie aeree 4,10. Inoltre, il modello IPTT presenta aggregati linfoidi, alcuni dei quali hanno venule endoteliali elevate che esprimono l’indirizzo del nodo periferico, indicando che si tratta di organi linfoidi terziari (TLO)7,8. I TLO assomigliano ai linfonodi e sono costituiti da cellule T, cellule B e, spesso, un centro germinativo accompagnato da cellule dendritiche follicolari11,12. I TLO sono stati riportati in varie malattie infiammatorie croniche, tra cui l’obliterazione delle vie aeree, rendendo il modello IPTT adatto per studiare il ruolo dei TLO nell’obliterazione delle vie aeree 7,8,11,12,13. Questo articolo presenta la metodologia del modello IPTT murino, con l’obiettivo di familiarizzare i ricercatori con questo modello e facilitare ulteriori indagini sull’obliterazione delle vie aeree dopo trapianto di polmone.
Protocol
Representative Results
Discussion
La procedura IPTT murina include passaggi critici. Per quanto riguarda l’anestesia, il primo passo cruciale è l’intubazione endotracheale. È essenziale tenere il topo ad un’altezza adeguata con le zampe sul tavolo per visualizzare le corde vocali e facilitare l’intubazione immediata. Inoltre, è necessaria un’attenta regolazione del volume respiratorio e della pressione positiva di fine espirazione (PEEP). In genere, un volume respiratorio di 500 μL e una PEEP di 2 cmH2O sono sufficienti per topi di peso 25…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano Jerome Valero per la cura di questo manoscritto. La Figura 1 e la Figura 3I,J,L sono state create con BioRender.com.
Materials
| BALB/cJ | The Jackson Laboratory | 8-10 weeks 25-30 g | Male, Donor |
| BD 1 mL Syringe | Becton Dickinson | 309659 | |
| BD PrecisionGlide Needle Aiguile BD PrecisionGlide |
Becton Dickinson | 305122 | |
| Bovie Change-A-Tip Deluxe High-Temperture | Bovie | DEL1 | |
| C57BL/6J | The Jackson Laboratory | 8-10 weeks 25-30 g | Male, Recipient |
| Dumont #5/45 Forceps | F·S·T | 11251-35 | |
| Ethicon Ligaclip Multiple -Clip Appliers- | Ethicon | LX107 | |
| Extra Fine Graefe Forceps | F·S·T | 11150-10 | |
| Glover Bulldog Clamp | Integra | 320-127 | |
| Halsted-Mosquito Hemostats | F·S·T | 13009-12 | |
| Horizon Titanium Ligating Clips | Teleflex | 001201 | |
| Leica M651 Manual surgical microscope for microsurgical procedures | Leica | ||
| Magnetix Fixator with spring lock | CD+ LABS | ACD-001 | |
| Microsurgical Scissor | Jarit | 277-051 | |
| Mouse and Perinatal Rat Ventilator Model 687 | Harvard | 55-0001 | |
| Perfadex Plus | XVIVO | 19850 | |
| Retractor Tip Blunt – 2.5 mm | CD+ LABS | ACD-011 | |
| small animal table | CD+ LABS | ACD-003 | |
| Surgipro Blue 24" CV-1 Taper, Double Armed | Covidien | VP702X | |
| Systane ointment | Alconn | 1444062 | |
| System Elastomer | CD+ LABS | ACD-007 | |
| Terumo Surflo IV Catheter, 20 G x 1 in | Terumo Medical Corporation | SR-OX2025CA | |
| VMT table Top | benson | 91803300 |
Riferimenti
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