Transplante de Traqueia Intrapulmonar Purino: Modelo para Investigação de Doença Obliterativa das Vias Aéreas Após Transplante Pulmonar
Summary
O modelo de transplante traqueal intrapulmonar murino (TTPI) é valioso para o estudo da doença obliterativa das vias aéreas (DAO) após o transplante pulmonar. Oferece informações sobre o comportamento imunológico e angiogênico pulmão-específico na obliteração das vias aéreas após alotransplante com alta reprodutibilidade. Descrevemos aqui o procedimento do IPTT e seus resultados esperados.
Abstract
O transplante traqueal intrapulmonar murino (TTPI) é usado como modelo de doença obliterativa das vias aéreas (DAO) após transplante pulmonar. Inicialmente relatado por nossa equipe, esse modelo tem ganhado uso no estudo da DAO devido à sua alta reprodutibilidade técnica e adequação para investigação de comportamentos imunológicos e intervenções terapêuticas.
No modelo IPTT, um enxerto traqueal de roedor é inserido diretamente no pulmão do receptor através da pleura. Esse modelo é distinto do transplante traqueal heterotópico (TCTH), em que os enxertos são transplantados para sítios subcutâneos ou omentais, e do transplante traqueal ortotópico (TTO), no qual a traqueia do doador substitui a traqueia do receptor.
O sucesso da implementação do modelo IPTT requer habilidades anestésicas e cirúrgicas avançadas. As habilidades anestésicas incluem intubação endotraqueal do receptor, ajuste de parâmetros ventilatórios apropriados e extubação adequadamente cronometrada após a recuperação da anestesia. As habilidades cirúrgicas são essenciais para a colocação precisa do enxerto dentro do pulmão e para garantir o selamento eficaz da pleura visceral para evitar vazamento de ar e sangramento. Em geral, o processo de aprendizagem leva aproximadamente 2 meses.
Em contraste com os modelos HTT e OTT, no modelo IPTT, a via aérea do aloenxerto desenvolve obliteração das vias aéreas no microambiente pulmonar relevante. Isso permite que os investigadores estudem os processos imunológicos e angiogênicos específicos do pulmão envolvidos na obliteração das vias aéreas após o transplante pulmonar. Além disso, esse modelo também é único por exibir órgãos linfoides terciários (TLOs), que também são vistos em aloenxertos pulmonares humanos. Os TLOs são compostos por populações de células T e B e caracterizados pela presença de vênulas endoteliais elevadas que direcionam o recrutamento de células imunes; portanto, é provável que desempenhem um papel crucial na aceitação e rejeição do enxerto. Concluímos que o modelo IPTT é uma ferramenta útil para estudar as vias imunes e pró-fibróticas intrapulmonares envolvidas no desenvolvimento da obliteração das vias aéreas no aloenxerto de transplante pulmonar.
Introduction
O transplante pulmonar tem sido estabelecido como um tratamento eficaz para pacientes com doenças respiratórias em estágio terminal. Entretanto, a sobrevida mediana dos receptores de transplante pulmonar humano é de apenas aproximadamente 6 anos, sendo o desenvolvimento de bronquiolite obliterante (BO), um tipo de doença obstrutiva das vias aéreas (DAO), uma das principais causas de morte após o primeiro ano pós-transplante1.
Vários modelos animais têm sido utilizados para investigar o mecanismo subjacente à DAO. Um desses modelos é o transplante traqueal heterotópico (TCT)2. Nesse modelo, os enxertos traqueais são implantados no tecido subcutâneo ou no omento do receptor. Ocorre perda de células epiteliais do enxerto traqueal induzida por isquemia, seguida de infiltração linfocitária aloreativa e apoptose de células epiteliais doadoras. Fibroblastos e miofibroblastos migram ao redor da traqueia, produzindo uma matriz extracelular. Finalmente, ocorre obliteração fibrosa completa da luz das vias aéreas. O modelo HTT é tecnicamente simples, proporciona um ambiente in vivo e oferece alta reprodutibilidade.
Outro modelo para o estudo da DAO é o transplante traqueal ortotópico de ratos (TTO), em que enxertos traqueais são interpostos na traqueia do receptor para manter a ventilação fisiológica3. Nesse modelo, a depleção induzida por isquemia das células epiteliais do doador resulta na sua substituição por células epiteliais receptoras dentro da traqueia, formando uma via aérea desobstruída acompanhada de fibrose moderada. Embora esses modelos tenham contribuído para o entendimento da obliteração das vias aéreas após o transplante pulmonar, eles apresentam limitações em termos de recapitulação do microambiente do parênquima pulmonar.
Nosso grupo de pesquisa introduziu o modelo de transplante traqueal intrapulmonar (TTPI) de ratos, no qual enxertos traqueais são implantadosno pulmão receptor4 (Figura 1). O modelo IPTT exibe obliteração fibrosa da luz das vias aéreas ocorrendo dentro do microambiente pulmonar. Além disso, tem sido aplicado com sucesso em camundongos tecnicamente mais desafiadores que o IPTTde ratos5,6,7,8,9,10. Essa adaptação do modelo murino IPTT nos permitiu aprofundar os intrincados detalhes do ambiente imunológico pulmonar da DAO após transplante pulmonar usando camundongos transgênicos.
O modelo IPTT possui algumas características únicas. Uma delas é a neoangiogênese, que é facilitada pela circulação pulmonar e desempenha papel crucial na obliteração das vias aéreas 4,10. Além disso, o modelo IPTT exibe agregados linfoides, alguns dos quais com vênulas endoteliais elevadas expressando endereçina linfonodal periférica, indicando que são órgãos linfoides terciários (TLOs)7,8. Os TLOs assemelham-se a linfonodos e consistem de células T, células B e, frequentemente, um centro germinativo acompanhado de células dendríticas foliculares11,12. TLOs têm sido relatados em várias doenças inflamatórias crônicas, incluindo a obliteração das vias aéreas, tornando o modelo IPTT adequado para investigar o papel das OTTs na obliteração das vias aéreas 7,8,11,12,13. Este artigo apresenta a metodologia do modelo murino IPTT, com o objetivo de familiarizar os pesquisadores com esse modelo e facilitar investigações adicionais sobre a obliteração das vias aéreas após o transplante pulmonar.
Protocol
Representative Results
Discussion
O procedimento murino IPTT inclui etapas críticas. Em relação à anestesia, o primeiro passo crucial é a intubação endotraqueal. É essencial segurar o rato a uma altura adequada com as pernas sobre a mesa para visualizar as cordas vocais e facilitar a intubação imediata. Além disso, é necessário um ajuste cuidadoso do volume respiratório e da pressão expiratória final positiva (PEEP). Normalmente, um volume respiratório de 500 μL e uma PEEP de 2 cmH2O são suficientes para camundongos pesando …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de agradecer a Jerome Valero pela edição deste manuscrito. A Figura 1 e a Figura 3I,J,L foram criadas com BioRender.com.
Materials
| BALB/cJ | The Jackson Laboratory | 8-10 weeks 25-30 g | Male, Donor |
| BD 1 mL Syringe | Becton Dickinson | 309659 | |
| BD PrecisionGlide Needle Aiguile BD PrecisionGlide |
Becton Dickinson | 305122 | |
| Bovie Change-A-Tip Deluxe High-Temperture | Bovie | DEL1 | |
| C57BL/6J | The Jackson Laboratory | 8-10 weeks 25-30 g | Male, Recipient |
| Dumont #5/45 Forceps | F·S·T | 11251-35 | |
| Ethicon Ligaclip Multiple -Clip Appliers- | Ethicon | LX107 | |
| Extra Fine Graefe Forceps | F·S·T | 11150-10 | |
| Glover Bulldog Clamp | Integra | 320-127 | |
| Halsted-Mosquito Hemostats | F·S·T | 13009-12 | |
| Horizon Titanium Ligating Clips | Teleflex | 001201 | |
| Leica M651 Manual surgical microscope for microsurgical procedures | Leica | ||
| Magnetix Fixator with spring lock | CD+ LABS | ACD-001 | |
| Microsurgical Scissor | Jarit | 277-051 | |
| Mouse and Perinatal Rat Ventilator Model 687 | Harvard | 55-0001 | |
| Perfadex Plus | XVIVO | 19850 | |
| Retractor Tip Blunt – 2.5 mm | CD+ LABS | ACD-011 | |
| small animal table | CD+ LABS | ACD-003 | |
| Surgipro Blue 24" CV-1 Taper, Double Armed | Covidien | VP702X | |
| Systane ointment | Alconn | 1444062 | |
| System Elastomer | CD+ LABS | ACD-007 | |
| Terumo Surflo IV Catheter, 20 G x 1 in | Terumo Medical Corporation | SR-OX2025CA | |
| VMT table Top | benson | 91803300 |
Riferimenti
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