Overvåking av fin og assosiativ motorisk læring hos mus ved hjelp av Erasmus-stigen

Summary

Denne artikkelen presenterer en protokoll som tillater en ikke-invasiv og automatisert vurdering av finmotorisk ytelse, samt adaptiv og assosiativ motorisk læring ved utfordringer, ved hjelp av en enhet kalt Erasmus Ladder. Oppgaveproblemer kan titreres for å oppdage motorisk svekkelse fra store til subtile grader.

Abstract

Atferd er formet av handlinger, og handlinger krever motoriske ferdigheter som styrke, koordinering og læring. Ingen av atferdene som er avgjørende for å opprettholde livet, ville være mulige uten evnen til å overgå fra en posisjon til en annen. Dessverre kan motoriske ferdigheter bli kompromittert i et bredt spekter av sykdommer. Derfor er det avgjørende å undersøke mekanismene for motorfunksjoner på cellulært, molekylært og kretsnivå, samt å forstå symptomene, årsakene og progresjonen av motoriske lidelser. Musemodeller brukes ofte til dette formålet.

Denne artikkelen beskriver en protokoll som tillater overvåking av ulike aspekter av motorisk ytelse og læring hos mus ved hjelp av et automatisert verktøy kalt Erasmus Ladder. Analysen innebærer to faser: en innledende fase hvor mus er opplært til å navigere i en horisontal stige bygget av uregelmessige trinn (“finmotorisk læring”), og en andre fase hvor et hinder presenteres i banen til det bevegelige dyret. Forstyrrelsen kan være uventet (“utfordret motorisk læring”) eller innledes med en auditiv tone (“assosiativ motorisk læring”). Oppgaven er enkel å utføre og støttes fullt ut av automatisert programvare.

Denne rapporten viser hvordan forskjellige avlesninger fra testen, når de analyseres med sensitive statistiske metoder, tillater fin overvåking av musemotoriske ferdigheter ved hjelp av en liten kohorte mus. Vi foreslår at metoden vil være svært følsom for å evaluere motortilpasninger drevet av miljømodifikasjoner, samt subtile motoriske underskudd i mutante mus med kompromitterte motorfunksjoner.

Introduction

En rekke tester er utviklet for å vurdere motoriske fenotyper hos mus. Hver test gir informasjon om et bestemt aspekt av motorisk oppførsel¹. For eksempel informerer åpen felttest om generell bevegelse og angsttilstand; rotarod og gangstråletester på koordinering og balanse; fotavtrykksanalyse handler om ganglag; tredemølle eller løpehjul på tvungen eller frivillig fysisk trening; Og det komplekse hjulet handler om læring av motoriske ferdigheter. For å analysere musemotorfenotyper må etterforskerne utføre disse testene sekvensielt, noe som innebærer mye tid og krefter og ofte flere dyrekohorter. Hvis det er informasjon på mobil- eller kretsnivå, velger etterforskeren normalt en test som overvåker et relatert aspekt og følger derfra. Imidlertid mangler paradigmer som diskriminerer ulike aspekter av motorisk oppførsel på en automatisert måte.

Denne artikkelen beskriver en protokoll for å bruke Erasmus Ladder ^2,3, et system som tillater omfattende vurdering av en rekke motoriske læringsfunksjoner hos mus. De viktigste fordelene er reproduserbarheten og følsomheten til metoden, sammen med evnen til å titrere motoriske vanskeligheter og å skille underskudd i motorisk ytelse fra nedsatt assosiativ motorlæring. Hovedkomponenten består av en horisontal stige med alternative høye (H) og lave (L) trinn utstyrt med berøringsfølsomme sensorer som oppdager musens posisjon på stigen. Stigen er laget av 2 x 37 trinn (L, 6 mm; H, 12 mm) fordelt 15 mm fra hverandre og plassert i et vekslende mønster mellom venstre og høyre med 30 mm mellomrom (figur 1A). Rungs kan flyttes individuelt for å generere ulike vanskelighetsgrader, det vil si å skape et hinder (heve de høye trinnene med 18 mm). Sammen med et automatisert opptakssystem og assosiere modifikasjoner av trinnmønsteret med sensoriske stimuli, tester Erasmus-stigen for finmotorisk læring og tilpasning av motorisk ytelse som svar på miljøutfordringer (utseende av et høyere trinn for å simulere et hinder, en ubetinget stimulus [US]) eller tilknytning til sensoriske stimuli (en tone, en betinget stimulus [CS]). Testing involverer to forskjellige faser, som hver vurderer forbedring i motorisk ytelse over 4 dager, hvor mus gjennomgår en økt på 42 påfølgende forsøk per dag. I den innledende fasen trenes mus til å navigere stigen for å vurdere “fin” eller “dyktig” motorisk læring. Den andre fasen består av sammenflettede forsøk hvor et hinder i form av et høyere trinn presenteres i banen til det bevegelige dyret. Forstyrrelsen kan være uventet for å vurdere “utfordret” motorisk læring (amerikanske bare forsøk) eller annonsert av en auditiv tone for å vurdere “assosiativ” motorisk læring (parvise studier).

Erasmus-stigen har blitt utviklet relativt nylig ^2,3. Det har ikke blitt mye brukt fordi oppsett og optimalisering av protokollen krevde fokusert innsats og ble spesielt designet for å vurdere cerebellaravhengig assosiativ læring uten å utforske i detalj potensialet for å avsløre andre motoriske underskudd. Hittil har det blitt validert for sin evne til å avdekke subtile motoriske funksjonsnedsettelser knyttet til cerebellar dysfunksjon hos mus 3,4,5,6,7,8. For eksempel viser connexin36 (Cx36) knockoutmus, hvor gapskryss er svekket i ovarienevroner, avfyringsunderskudd på grunn av mangel på elektrotonisk kobling, men den motoriske fenotypen hadde vært vanskelig å finne. Testing ved hjelp av Erasmus-stigen antydet at rollen til dårligere ovarienevroner i en cerebellar motorisk læringsoppgave er å kode presis tidsmessig koding av stimuli og legge til rette for læringsavhengige responser på uventede hendelser ^3,4. Fragilt X Messenger ribonukleoprotein 1 (Fmr1) knockoutmus, en modell for Fragile-X-syndrom (FXS), viser en velkjent kognitiv svekkelse sammen med mildere defekter i prosessuell minnedannelse. Fmr1 knockouts viste ingen signifikante forskjeller i trinntider, feiltrinn per forsøk eller motorisk ytelsesforbedring over økter i Erasmus-stigen, men klarte ikke å justere gangmønsteret til det plutselig synlige hinderet sammenlignet med deres villtype (WT) kullkamerater, og bekreftet spesifikke prosessuelle og assosiative minneunderskudd ^3,5. Videre viste cellespesifikke musemutantlinjer med defekter i cerebellar funksjon, inkludert nedsatt Purkinje-celleutgang, potensering og molekylære lag interneuron eller granulatcelleutganger, problemer i motorisk koordinering med endret oppkjøp av effektive trinnmønstre og i antall trinn som ble tatt for å krysse stigen⁶. Neonatal hjerneskade forårsaker cerebellar læringsunderskudd og Purkinje celledysfunksjon som også kan oppdages med Erasmus Ladder ^7,8.

I denne videoen presenterer vi en omfattende trinnvis veiledning, som beskriver oppsettet av atferdsrommet, atferdstestprotokollen og påfølgende dataanalyse. Denne rapporten er laget for å være tilgjengelig og brukervennlig og er designet spesielt for å hjelpe nykommere. Denne protokollen gir innsikt i ulike faser av motorisk trening og forventede motoriske mønstre som mus adopterer. Til slutt foreslår artikkelen en systematisk arbeidsflyt for dataanalyse ved hjelp av en kraftig ikke-lineær regresjonstilnærming, komplett med verdifulle anbefalinger og forslag til tilpasning og anvendelse av protokollen i andre forskningssammenhenger.

Protocol

I den nåværende studien ble voksne (2-3 måneder gamle) C57BL/6J-mus av begge kjønn brukt. Dyrene ble plassert to til fem per bur med ad libitum tilgang til mat og vann i en dyreenhet under observasjon og opprettholdt i et temperaturkontrollert miljø på en 12 timers mørk / lys syklus. Alle prosedyrer ble utført i samsvar med europeiske og spanske forskrifter (2010/63/UE; RD 53/2013) og ble godkjent av den etiske komiteen for Generalitat Valenciana og dyrevelferdskomiteen ved Universidad Miguel Hernández….

Representative Results

Erasmus Ladder-enheten, oppsettet og protokollen som er brukt, er presentert i figur 1. Protokollen består av fire uforstyrrede og fire utfordringsøkter (42 forsøk hver). Hvert forsøk er ett løp på stigen mellom start- og sluttmålsboksene. I begynnelsen av økten plasseres en mus i en av startboksene. Etter en innstilt tid på 15 ± 5 s (“hvilende” tilstand), slås lyset på (cue 1, for maksimalt 3 s). En lett luftkø (kø 2, maksimalt 45 s) påføres deretter for å oppmuntre musene …

Discussion

Erasmus-stigen gir store fordeler for vurdering av motorfenotype utover dagens tilnærminger. Testing er enkel å utføre, automatisert, reproduserbar, og lar forskere vurdere ulike aspekter av motorisk oppførsel separat ved hjelp av en enkelt musekohort. I den nåværende studien tillot reproduserbarhet generering av robuste data med et lite antall WT-mus som utnyttet funksjonene til enheten, eksperimentell design og analysemetoder. For eksempel, sammenlignet med tradisjonelle stråleganganalyser, øker tillegg av moti…

Materials

C57BL/6J mice (Mus musculus)	Charles Rivers
Erasmus Ladder device	Noldus, Wageningen, Netherlands
Erasmus Ladder 2.0 software	Noldus, Wageningen, Netherlands
Excel software	Microsoft
Sigmaplot software	Systat Software, Inc.