Pulizia ottica ed etichettatura per la microscopia a fluorescenza a foglio luminoso nell'imaging cerebrale umano su larga scala

Danila Di Meo; Josephine Ramazzotti; Marina Scardigli; Franco Cheli; Luca Pesce; Niamh Brady; Giacomo Mazzamuto; Irene Costantini; Francesco S. Pavone

doi:10.3791/65960

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Articolo metodologico

Pulizia ottica ed etichettatura per la microscopia a fluorescenza a foglio luminoso nell'imaging cerebrale umano su larga scala

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DOI:

10.3791/65960

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26 gennaio 2024

Danila Di Meo^*¹ , Josephine Ramazzotti^*¹ , Marina Scardigli^*¹^,² , Franco Cheli¹ , Luca Pesce¹^,³ , Niamh Brady¹ , Giacomo Mazzamuto¹^,⁴^,⁵ , Irene Costantini¹^,⁴^,⁶ , Francesco S. Pavone¹^,⁴^,⁵

¹European Laboratory for Non-linear Spectroscopy (LENS), University of Florence, ²Division of Physiology, Department of Experimental and Clinical Medicine, University of Florence, ³Department of Physics, University of Pisa, ⁴National Research Council - National Institute of Optics (CNR-INO), ⁵Department of Physics and Astronomy, University of Florence, ⁶Department of Biology, University of Florence

^* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Il presente protocollo fornisce una procedura passo-passo per la clearing ottica rapida e simultanea, la marcatura multi-round e la ricostruzione volumetrica 3D di decine di sezioni di cervello umano post-mortem combinando la tecnica di trasformazione tissutale corta (SWITCH - H₂O₂- Antigen Retrieval - 2,2'-tiodiethanol [TDE]) SHORT con l'imaging al microscopio a fluorescenza a foglio luminoso in un protocollo di routine ad alto rendimento.

Abstract

Nonostante le numerose tecniche di clearing emerse nell'ultimo decennio, l'elaborazione post-mortem del cervello umano rimane un compito impegnativo a causa delle sue dimensioni e complessità, che rendono particolarmente difficile l'imaging con risoluzione micrometrica. Questo articolo presenta un protocollo per eseguire la ricostruzione di porzioni volumetriche del cervello umano elaborando simultaneamente decine di sezioni con il protocollo di trasformazione tissutale SHORT (SWITCH - H₂O₂- Antigen Retrieval - 2,2'-thiodiethanol [TDE]), che consente la clearing, la marcatura e l'imaging sequenziale dei campioni con microscopia a fluorescenza a foglio di luce (LSFM). SHORT fornisce una rapida pulizia dei tessuti e una marcatura multipla omogenea di fette spesse con diversi marcatori neuronali, consentendo l'identificazione di diverse sottopopolazioni neuronali sia nella materia bianca che in quella grigia. Dopo la pulizia, le fette vengono visualizzate tramite LSFM con risoluzione micrometrica e in più canali contemporaneamente per una rapida ricostruzione 3D. Combinando l'analisi SHORT con LSFM all'interno di un protocollo di routine ad alto rendimento, è possibile ottenere la ricostruzione della citoarchitettura 3D di grandi aree volumetriche ad alta risoluzione in breve tempo, consentendo così una caratterizzazione strutturale completa del cervello umano.

Introduzione

L'analisi dell'organizzazione molecolare 3D e della citoarchitettura di grandi volumi del cervello umano richiede la trasparenza ottica dei campioni, ottenuta attraverso protocolli con tempi di elaborazione estesi. Le tecniche di compensazione ottica sono state sviluppate per ridurre al minimo l'eterogeneità dell'indice di rifrazione (RI) all'interno dei tessuti, riducendo così la dispersione della luce e aumentando la profondità di penetrazione della luce per l'imaging ad alta risoluzione 1,2,3,4,5. Gli at....