העשרה מהירה ויעילה של תאי מיקרוגליה בחוט השדרה של עכבר
Summary
מיקרוגליה נחשבים לחלק מהתאים הרבגוניים ביותר בגוף, המסוגלים להסתגלות מורפולוגית ותפקודית. ההטרוגניות והרב-תכליתיות שלהם מאפשרות שמירה על הומאוסטזיס מוחי, תוך שהם קשורים גם לפתולוגיות נוירולוגיות שונות. כאן מתוארת טכניקה לטיהור מיקרוגליה של חוט השדרה.
Abstract
עמוד השדרה מגדיר חוליה ומעצב את תעלת עמוד השדרה, חלל התוחם ושומר על חוט השדרה. התפתחות ותפקוד תקין של מערכת העצבים המרכזית של יונקים מסתמכים באופן משמעותי על פעילותם של מקרופאגים מקומיים המכונים מיקרוגליה. מיקרוגליה מציגה הטרוגניות ורב-תפקודיות, ומאפשרת ביטוי גנים והתנהגות מובחנים בתוך חוט השדרה והמוח. מחקרים רבים בחנו את תפקוד תאי המיקרוגליה במוח, ומפרטים בהרחבה את שיטות הטיהור. עם זאת, טיהור תאי מיקרוגליה מחוט השדרה בעכברים חסר תיאור מקיף. לעומת זאת, השימוש בקולגנאז מטוהר מאוד, בניגוד לתמצית לא מזוקקת, חסר דיווח ברקמות מערכת העצבים המרכזית. במחקר זה, עמוד השדרה וחוט השדרה נכרתו מעכברי C57BL/6 בני 8-10 שבועות. העיכול שלאחר מכן השתמש בקולגנאז מטוהר מאוד, וטיהור מיקרוגליה השתמש בשיפוע צפיפות. התאים עברו צביעה לצורך ציטומטריית זרימה, הערכת כדאיות וטוהר באמצעות צביעת CD11b ו-CD45. התוצאות הניבו כדאיות ממוצעת של 80% וטוהר ממוצע של 95%. לסיכום, מניפולציה של מיקרוגליה בעכבר כללה עיכול עם קולגן מטוהר מאוד, ואחריו שיפוע צפיפות. גישה זו יצרה למעשה אוכלוסיות משמעותיות של מיקרוגליה בחוט השדרה.
Introduction
המאפיין המגדיר של בעלי חוליות הוא עמוד השדרה או עמוד השדרה, שבו הנוטוכורד הוחלף ברצף של עצמות מקוטעות הנקראות חוליות, המחולקות על ידי דיסקים בין-חולייתיים. רצף זה של חומר גלוסקמי מעצב את תעלת עמוד השדרה, חלל התוחם ומגן על חוט השדרה1. בסוג Rodentia, עמוד השדרה נוצר בדרך כלל על ידי שבע חוליות צוואריות, שלוש עשרה חוליות בית החזה, שש חוליות מותניות ומספר משתנה של חוליות קאודליות 2,3. אורך חוט השדרה דומה לזה של עמוד השדרה, והפילום הטרמינלי הוא מבנה לא עצבי המעגן את חוט השדרה לעצה. בנוסף, סיבי עצב יוצאים דרך הפתח הבין חולייתי1.
התפתחותה ותפקודה התקין של מערכת העצבים המרכזית ביונקים תלויים באופן קריטי בפעילות המקרופאגים השוכנים במערכת העצבים, הנקראים מיקרוגליה4. למרות שתאי מיקרוגליה תוארו בתחילה כפגוציטים שוכני מוח, מחקר שנערך לאחרונה ייחס תפקודים דינמיים רבים לתאים אלה 5,6. גודלה של מיקרוגליה נע בין 7 ל -10 מיקרומטר בהומאוסטזיס; הם נחשבים בין התאים הרבגוניים ביותר בגוף ויכולים להסתגל מורפולוגית ותפקודית לסביבתם המשתנה ללא הרף7. תאים אלה מפגינים הטרוגניות גבוהה הן בשלב העוברי והן בשלב הבוגר 8,9, ואילו בשלב הבוגר הם מפגינים גם הטרוגניות תפקודית מורכבת בהתבסס על ההקשר המרחבי-זמני שלהם10. ההטרוגניות והתפקודים המרובים של תאי מיקרוגליה מאפשרים ביטוי גנים דיפרנציאליים והתנהגות בחוט השדרה ובמוח. הוכח כי ביטוי CD11b, CD45, CD86 ו- CCR9 גבוה יותר בחוט השדרה בהשוואה למוח 8,9.
קיימים פרוטוקולים מרובים לבידוד תאי מיקרוגליה במוח11,12; עם זאת, רק מעטים קיימים עבור מיקרוגליה חוט השדרה13,14. אופטימיזציה של שיטה לטיהור מיקרוגליה מחוט השדרה מאפשרת פיתוח של מחקרים מרובים המתמקדים בגילוי הפיזיולוגיה של מיקרוגליה. פרוטוקול זה נועד לתאר מיצוי פשוט וקל מאוד לשחזור של חוט השדרה של העכבר וטיהור תאי מיקרוגליה (איור 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקולים רבים פותחו לחקר תאי מיקרוגליה בשל חשיבותם בהומאוסטזיס של המוח. בשיטות אלה, תאי מיקרוגליה מקורם בדרך כלל בהמיספרות מוחיות של חולדות ועכברים עובריים או יילודים17. מספר מצומצם של מחקרים התייחסו לטיהור תאי מיקרוגליה מחוט השדרה של עכברים בוגרים13,14<sup …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמלגה שהוענקה על ידי המועצה הלאומית למדע וטכנולוגיה (CONACYT) (702361). המחברים מודים לתוכנית הדוקטורט במדעי הכימיה הביולוגית של בית הספר הלאומי למדעים ביולוגיים של המכון הפוליטכני הלאומי.
Materials
| 15 mL collection tubes | Corning, USA | 430790 | |
| 2 mL microtubes | Axygen, USA | MCT-200-G | |
| 2.4G2 anti-FcR | BioLegend, USA | 101302 | |
| 50 mL collection tubes | Corning, USA | 430829 | |
| 70% ethanol | |||
| Antibiotic-Antimycotic (penicillin, streptomycin, amphotericin b) | Gibco, USA | 15240062 | |
| Antibody CD11b eFluor 450 anti-mouse | eBioscience, USA | 48-0112 | |
| Antibody CD45 PerCP anti-mouse | BioLegend, USA | 103130 | |
| Balanced salt solution (PBS) calcium- magnesium-free | Corning, USA | 46-013-CM | |
| Blue Cell Strainer 40 μm | Corning, USA | 352340 | |
| Costar 6-well Clear Not Treated | Corning, USA | CLS3736 | |
| Coverslips | |||
| Digital Heating Shaking Drybath | Thermo Scientific Digital HS Drybath, USA | 88870001 | |
| Dissecting forceps for microsurgery | FT by DUMONT | ||
| DNase | Roche, USA | 4536282001 | |
| Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium-high glucose (DMEM) | Merck, USA | D6429 | |
| Electric shaver | |||
| FACS tube | Thermo, USA | 352058 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | PAN Biotech, Alemania | P30-3306 | |
| Flow cytometer Cytoflex | Beckman Coulter | ||
| Hank’s balanced salt solution | Merck, USA | H2387 | |
| L-glutamine | Corning, USA | 15393631 | |
| Liberase TM | Roche, USA | 5401119001 | |
| Neubauer chamber Counting Chambers | China | 1103 | |
| Pentobarbital | |||
| Percoll | Merck, USA | 17089101 | density gradient centrifugation |
| Poly-L-lysine solution | Merck, USA | P8920 | |
| Scalpel No. 25 | HERGOM, Mexico | H23 | |
| Snaplock Microcentrifuge Tubes 2 mL | Axygen, USA | 10011-680 | |
| Stereoscopic microscope | Velab, Mexico | HG927831 | |
| Straight surgical scissors (10 cm) | HERGOM, Mexico | ||
| Straight Vannas scissors | HERGOM, Mexico | ||
| Triton X100 | Merck, USA | X100 | |
| Trypan blue Stain 0.4% | Merck, USA | 15250-061 | |
| Vortex mixer | DLAB, China | 8031102000 | |
| Zombie Aqua Fixable Viability Kit | BioLegend, USA | 423102 | amine-reactive fluorescent dye staining |
Riferimenti
- Schröder, H., Schröder, , Moser, , Huggenberger, , et al. . Neuroanatomy of the Mouse. , 59-78 (2020).
- Sengul, G., et al. Cytoarchitecture of the spinal cord of the postnatal (P4) mouse. Anat Rec. 295, 837-845 (2012).
- Bab, I., et al. . Microtomographic atlas of the mouse skeleton. VIII, 205 (2007).
- Nayak, D., et al. Microglia development and function. Annu Rev Immunol. 32, 367-402 (2014).
- Martinez, F. O., et al. Macrophage activation and polarization. Front Biosci. 13, 453-461 (2008).
- Masuda, T., et al. Microglia heterogeneity in the single-cell era. Cell Rep. 30 (5), 1271-1281 (2020).
- Prinz, M. Microglia biology: one century of evolving concepts. Cell. 179 (2), 292-311 (2019).
- de Haas, A. H., et al. Region-specific expression of immunoregulatory proteins on microglia in the healthy CNS. Glia. 56 (8), 888-894 (2008).
- Xuan, F. L., et al. Differences of microglia in the brain and the spinal cord. Front Cell Neurosci. 13, 504 (2019).
- Paolicelli, R. Microglia states and nomenclature: A field at its crossroads. Neuron. 110 (21), 3458-3483 (2022).
- Li, Q., et al. Spinal IL-36γ/IL-36R participates in the maintenance of chronic inflammatory pain through astroglial JNK pathway. Glia. 67 (3), 438-451 (2019).
- Prinz, M., et al. Microglia and central nervous system-associated macrophages-from origin to disease modulation. Annu Rev Immunol. 39, 251-277 (2021).
- Yip, P. K., et al. Rapid isolation and culture of primary microglia from adult mouse spinal cord. J Neurosci Methods. 183 (2), 223-237 (2009).
- Akhmetzyanova, E. R., et al. Severity- and time-dependent activation of microglia in spinal cord injury. Int J Mo. Sci. 24 (9), 1-16 (2023).
- Mahadevan, V. Anatomy of the vertebral column. Surgery. 36 (7), 327-332 (2018).
- Krukowski, K., et al. Temporary microglia-depletion after cosmic radiation modifies phagocytic activity and prevents cognitive deficits. Sci Rep. 8 (1), 1-13 (2018).
- Cardona, A., et al. Isolation of murine microglial cells for RNA analysis or flow cytometry. Nat Protoc. 1, 1947-1951 (2006).
- Schmidt, V. M., et al. Comparison of the enzymatic efficiency of Liberase TM and tumor dissociation enzyme: effect on the viability of cells digested from fresh and cryopreserved human ovarian cortex. Reprod Biol Endocrinol. 16 (57), 1-14 (2018).
- Kusminski, C. M., et al. MitoNEET-parkin effects in pancreatic α- and β-cells, cellular survival, and intrainsular cross talk. Diabetes. 65 (6), 1534-1555 (2016).
