الإثراء السريع والفعال للخلايا الدبقية الصغيرة للحبل الشوكي للفأر
Summary
تعتبر الخلايا الدبقية الصغيرة من أكثر الخلايا تنوعا في الجسم ، وهي قادرة على التكيف المورفولوجي والوظيفي. يتيح عدم تجانسها وتعدد وظائفها الحفاظ على توازن الدماغ ، بينما ترتبط أيضا بأمراض عصبية مختلفة. هنا ، يتم وصف تقنية لتنقية الخلايا الدبقية الصغيرة للحبل الشوكي.
Abstract
يحدد العمود الفقري الفقاريات ويشكل القناة الشوكية ، وهي تجويف يحيط بالحبل الشوكي ويحميه. يعتمد التطور السليم ووظيفة الجهاز العصبي المركزي للثدييات بشكل كبير على نشاط الضامة المقيمة المعروفة باسم الخلايا الدبقية الصغيرة. تظهر الخلايا الدبقية الصغيرة عدم التجانس وتعدد الوظائف ، مما يتيح التعبير الجيني المتميز والسلوك داخل الحبل الشوكي والدماغ. استكشفت العديد من الدراسات وظيفة الخلايا الدبقية الصغيرة الدماغية ، مع تفصيل طرق التنقية على نطاق واسع. ومع ذلك ، فإن تنقية الخلايا الدبقية الصغيرة من الحبل الشوكي في الفئران تفتقر إلى وصف شامل. في المقابل ، فإن استخدام كولاجيناز عالي النقاء ، على عكس المستخلص غير المكرر ، يفتقر إلى الإبلاغ داخل أنسجة الجهاز العصبي المركزي. في هذه الدراسة ، تم استئصال العمود الفقري والحبل الشوكي من الفئران C57BL / 6 البالغة من العمر 8-10 أسابيع. استخدم الهضم اللاحق كولاجيناز عالي النقاء ، واستخدمت تنقية الخلايا الدبقية الصغيرة تدرج الكثافة. خضعت الخلايا لتلطيخ لقياس التدفق الخلوي ، وتقييم الجدوى والنقاء من خلال تلطيخ CD11b و CD45. أسفرت النتائج عن متوسط صلاحية 80٪ ومتوسط نقاء 95٪. في الختام ، تضمن التلاعب بالخلايا الدبقية الصغيرة للفأر عملية الهضم باستخدام كولاجيناز عالي النقاء ، يليه تدرج الكثافة. أنتج هذا النهج بشكل فعال أعدادا كبيرة من الخلايا الدبقية الصغيرة للحبل الشوكي.
Introduction
السمة المميزة للفقاريات هي العمود الفقري أو العمود الفقري ، حيث تم استبدال notochord بسلسلة من العظام المجزأة تسمى الفقرات ، مقسومة على أقراص الفقرية. هذا التعاقب من المواد العظمية يشكل القناة الشوكية ، وهو تجويف يحيط ويحمي الحبل الشوكي1. في جنس Rodentia ، يتكون العمود الفقري عادة من سبع فقرات عنق الرحم ، وثلاثة عشر فقرة صدرية ، وست فقرات قطنية ، وعدد متغير من الفقرات الذيلية 2,3. طول الحبل الشوكي مشابه لطول العمود الفقري، والخيط الطرفي هو تركيب غير عصبي يثبت الحبل الشوكي بالعجز. بالإضافة إلى ذلك ، تخرج الألياف العصبية من خلال الثقبة الفقرية1.
يعتمد التطور والوظيفة المناسبة للجهاز العصبي المركزي في الثدييات بشكل حاسم على نشاط الضامة المقيمة في الجهاز العصبي ، والتي تسمى الخلايا الدبقية الصغيرة4. على الرغم من أن الخلايا الدبقية الصغيرة وصفت في البداية بأنها خلايا بلعمية مقيمة في الدماغ ، فقد عزت الأبحاث الحديثة العديد من الوظائف الديناميكية إلى هذه الخلايا 5,6. يتراوح حجم الخلايا الدبقية الصغيرة من 7 إلى 10 ميكرومتر في التوازن. تعتبر من بين الخلايا الأكثر تنوعا في الجسم ويمكن أن تتكيف شكليا ووظيفيا مع بيئتها المتغيرة باستمرار7. تظهر هذه الخلايا عدم تجانس عالي خلال كل من المرحلتين الجنينية والبالغة 8,9 ، بينما في مرحلة البلوغ ، فإنها تظهر أيضا عدم تجانس وظيفي معقد بناء على سياقها الزماني المكاني10. يسمح عدم التجانس والوظائف المتعددة للخلايا الدبقية الصغيرة بالتعبير الجيني التفاضلي والسلوك في الحبل الشوكي والدماغ. لقد ثبت أن تعبير CD11b و CD45 و CD86 و CCR9 أعلى في الحبل الشوكي مقارنة بالدماغ 8,9.
توجد بروتوكولات متعددة لعزل الخلايا الدبقية الصغيرة الدماغية11,12 ؛ ومع ذلك ، لا يوجد سوى عدد قليل من الخلايا الدبقية الصغيرة للحبل الشوكي13,14. إن تحسين طريقة لتنقية الخلايا الدبقية الصغيرة من الحبل الشوكي يسهل تطوير دراسات متعددة تركز على اكتشاف فسيولوجيا الخلايا الدبقية الصغيرة. يهدف هذا البروتوكول إلى وصف استخراج بسيط وقابل للتكرار للغاية للحبل الشوكي للفأر وتنقية الخلايا الدبقية الصغيرة (الشكل 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
تم تطوير العديد من البروتوكولات لدراسة الخلايا الدبقية الصغيرة بسبب أهميتها في توازن الدماغ. في هذه الطرق ، يتم الحصول على الخلايا الدبقية الصغيرة عادة من نصفي الكرة المخية للجرذان والفئران الجنينية أو حديثي الولادة17. تناول عدد محدود من الدراسات تنقية الخلايا الدبقية الصغي?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل بمنح من المنح الدراسية المقدمة من المجلس الوطني للعلوم والتكنولوجيا (CONACYT) (702361). يعترف المؤلفون بالدكتوراه برنامج في العلوم الكيميائية البيولوجية من المدرسة الوطنية للعلوم البيولوجية التابعة للمعهد الوطني للفنون التطبيقية.
Materials
| 15 mL collection tubes | Corning, USA | 430790 | |
| 2 mL microtubes | Axygen, USA | MCT-200-G | |
| 2.4G2 anti-FcR | BioLegend, USA | 101302 | |
| 50 mL collection tubes | Corning, USA | 430829 | |
| 70% ethanol | |||
| Antibiotic-Antimycotic (penicillin, streptomycin, amphotericin b) | Gibco, USA | 15240062 | |
| Antibody CD11b eFluor 450 anti-mouse | eBioscience, USA | 48-0112 | |
| Antibody CD45 PerCP anti-mouse | BioLegend, USA | 103130 | |
| Balanced salt solution (PBS) calcium- magnesium-free | Corning, USA | 46-013-CM | |
| Blue Cell Strainer 40 μm | Corning, USA | 352340 | |
| Costar 6-well Clear Not Treated | Corning, USA | CLS3736 | |
| Coverslips | |||
| Digital Heating Shaking Drybath | Thermo Scientific Digital HS Drybath, USA | 88870001 | |
| Dissecting forceps for microsurgery | FT by DUMONT | ||
| DNase | Roche, USA | 4536282001 | |
| Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium-high glucose (DMEM) | Merck, USA | D6429 | |
| Electric shaver | |||
| FACS tube | Thermo, USA | 352058 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | PAN Biotech, Alemania | P30-3306 | |
| Flow cytometer Cytoflex | Beckman Coulter | ||
| Hank’s balanced salt solution | Merck, USA | H2387 | |
| L-glutamine | Corning, USA | 15393631 | |
| Liberase TM | Roche, USA | 5401119001 | |
| Neubauer chamber Counting Chambers | China | 1103 | |
| Pentobarbital | |||
| Percoll | Merck, USA | 17089101 | density gradient centrifugation |
| Poly-L-lysine solution | Merck, USA | P8920 | |
| Scalpel No. 25 | HERGOM, Mexico | H23 | |
| Snaplock Microcentrifuge Tubes 2 mL | Axygen, USA | 10011-680 | |
| Stereoscopic microscope | Velab, Mexico | HG927831 | |
| Straight surgical scissors (10 cm) | HERGOM, Mexico | ||
| Straight Vannas scissors | HERGOM, Mexico | ||
| Triton X100 | Merck, USA | X100 | |
| Trypan blue Stain 0.4% | Merck, USA | 15250-061 | |
| Vortex mixer | DLAB, China | 8031102000 | |
| Zombie Aqua Fixable Viability Kit | BioLegend, USA | 423102 | amine-reactive fluorescent dye staining |
Riferimenti
- Schröder, H., Schröder, , Moser, , Huggenberger, , et al. . Neuroanatomy of the Mouse. , 59-78 (2020).
- Sengul, G., et al. Cytoarchitecture of the spinal cord of the postnatal (P4) mouse. Anat Rec. 295, 837-845 (2012).
- Bab, I., et al. . Microtomographic atlas of the mouse skeleton. VIII, 205 (2007).
- Nayak, D., et al. Microglia development and function. Annu Rev Immunol. 32, 367-402 (2014).
- Martinez, F. O., et al. Macrophage activation and polarization. Front Biosci. 13, 453-461 (2008).
- Masuda, T., et al. Microglia heterogeneity in the single-cell era. Cell Rep. 30 (5), 1271-1281 (2020).
- Prinz, M. Microglia biology: one century of evolving concepts. Cell. 179 (2), 292-311 (2019).
- de Haas, A. H., et al. Region-specific expression of immunoregulatory proteins on microglia in the healthy CNS. Glia. 56 (8), 888-894 (2008).
- Xuan, F. L., et al. Differences of microglia in the brain and the spinal cord. Front Cell Neurosci. 13, 504 (2019).
- Paolicelli, R. Microglia states and nomenclature: A field at its crossroads. Neuron. 110 (21), 3458-3483 (2022).
- Li, Q., et al. Spinal IL-36γ/IL-36R participates in the maintenance of chronic inflammatory pain through astroglial JNK pathway. Glia. 67 (3), 438-451 (2019).
- Prinz, M., et al. Microglia and central nervous system-associated macrophages-from origin to disease modulation. Annu Rev Immunol. 39, 251-277 (2021).
- Yip, P. K., et al. Rapid isolation and culture of primary microglia from adult mouse spinal cord. J Neurosci Methods. 183 (2), 223-237 (2009).
- Akhmetzyanova, E. R., et al. Severity- and time-dependent activation of microglia in spinal cord injury. Int J Mo. Sci. 24 (9), 1-16 (2023).
- Mahadevan, V. Anatomy of the vertebral column. Surgery. 36 (7), 327-332 (2018).
- Krukowski, K., et al. Temporary microglia-depletion after cosmic radiation modifies phagocytic activity and prevents cognitive deficits. Sci Rep. 8 (1), 1-13 (2018).
- Cardona, A., et al. Isolation of murine microglial cells for RNA analysis or flow cytometry. Nat Protoc. 1, 1947-1951 (2006).
- Schmidt, V. M., et al. Comparison of the enzymatic efficiency of Liberase TM and tumor dissociation enzyme: effect on the viability of cells digested from fresh and cryopreserved human ovarian cortex. Reprod Biol Endocrinol. 16 (57), 1-14 (2018).
- Kusminski, C. M., et al. MitoNEET-parkin effects in pancreatic α- and β-cells, cellular survival, and intrainsular cross talk. Diabetes. 65 (6), 1534-1555 (2016).
