Snelle en efficiënte verrijking van microglia van het ruggenmerg van muizen
Summary
Microglia worden beschouwd als enkele van de meest veelzijdige cellen in het lichaam, die in staat zijn tot morfologische en functionele aanpassing. Hun heterogeniteit en multifunctionaliteit maken het mogelijk om de homeostase van de hersenen te handhaven, terwijl ze ook in verband worden gebracht met verschillende neurologische pathologieën. Hier wordt een techniek beschreven voor het zuiveren van microglia van het ruggenmerg.
Abstract
De wervelkolom definieert een gewerveld dier en vormt het wervelkanaal, een holte die het ruggenmerg omsluit en beschermt. Een goede ontwikkeling en functie van het centrale zenuwstelsel van zoogdieren zijn in belangrijke mate afhankelijk van de activiteit van residente macrofagen die bekend staan als microglia. Microglia vertonen heterogeniteit en multifunctionaliteit, waardoor verschillende genexpressie en gedrag in het ruggenmerg en de hersenen mogelijk zijn. Talrijke studies hebben de functie van de cerebrale microglia onderzocht, waarbij de zuiveringsmethoden uitgebreid worden beschreven. De zuivering van microglia uit het ruggenmerg bij muizen mist echter een uitgebreide beschrijving. Daarentegen ontbreekt het gebruik van een sterk gezuiverd collagenase, in tegenstelling tot een ongeraffineerd extract, aan rapportage in weefsels van het centrale zenuwstelsel. In deze studie werden de wervelkolom en het ruggenmerg weggesneden van 8-10 weken oude C57BL/6-muizen. De daaropvolgende vertering maakte gebruik van een sterk gezuiverd collagenase en de zuivering van microglia maakte gebruik van een dichtheidsgradiënt. Cellen ondergingen kleuring voor flowcytometrie, waarbij de levensvatbaarheid en zuiverheid werden beoordeeld door middel van CD11b- en CD45-kleuring. De resultaten leverden een gemiddelde levensvatbaarheid van 80% en een gemiddelde zuiverheid van 95% op. Concluderend betrof manipulatie van microglia van muizen spijsvertering met een sterk gezuiverd collagenase, gevolgd door een dichtheidsgradiënt. Deze aanpak produceerde effectief substantiële populaties microglia in het ruggenmerg.
Introduction
Het bepalende kenmerk van gewervelde dieren is de wervelkolom of wervelkolom, waarin het notochord is vervangen door een opeenvolging van gesegmenteerde botten die wervels worden genoemd, gedeeld door tussenwervelschijven. Deze opeenvolging van botmateriaal vormt het wervelkanaal, een holte die hetruggenmerg omsluit en beschermt. In het geslacht Rodentia wordt de wervelkolom meestal gevormd door zeven halswervels, dertien borstwervels, zes lendenwervels en een variabel aantal staartwervels 2,3. De lengte van het ruggenmerg is vergelijkbaar met die van de wervelkolom en het terminale filum is een niet-nerveuze structuur die het ruggenmerg aan het heiligbeen verankert. Bovendien komen zenuwvezels naar buiten via het foramen tussen de wervels1.
De ontwikkeling en goede werking van het centrale zenuwstelsel bij zoogdieren hangt in belangrijke mate af van de activiteit van de inwonende macrofagen van het zenuwstelsel, microglia4 genaamd. Hoewel microglia aanvankelijk werden beschreven als fagocyten die in de hersenen wonen, heeft recent onderzoek veel dynamische functies aan deze cellen toegeschreven 5,6. De grootte van microglia varieert van 7 tot 10 μm in homeostase; Ze worden beschouwd als een van de meest veelzijdige cellen in het lichaam en kunnen zich morfologisch en functioneel aanpassen aan hun voortdurend veranderende omgeving7. Deze cellen vertonen een hoge heterogeniteit tijdens zowel de embryonale als de volwassen fase8,9, terwijl ze in de volwassen fase ook complexe functionele heterogeniteit vertonen op basis van hun spatiotemporele context10. De heterogeniteit en meerdere functies van microglia zorgen voor differentiële genexpressie en gedrag in het ruggenmerg en de hersenen. Het is aangetoond dat de expressie van CD11b, CD45, CD86 en CCR9 hoger is in het ruggenmerg in vergelijking met de hersenen 8,9.
Er bestaan meerdere protocollen voor isolatie van cerebrale microglia11,12; Er zijn er echter maar een paar voor microglia van het ruggenmerg13,14. Het optimaliseren van een methode voor het zuiveren van microglia uit het ruggenmerg vergemakkelijkt de ontwikkeling van meerdere studies gericht op het ontdekken van de fysiologie van microglia. Dit protocol heeft tot doel een eenvoudige en zeer reproduceerbare extractie van het ruggenmerg van de muis en de zuivering van microglia te beschrijven (Figuur 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Er zijn talloze protocollen ontwikkeld voor de studie van microglia vanwege hun betekenis in de homeostase van de hersenen. Bij deze methoden zijn microglia meestal afkomstig van de hersenhelften van embryonale of neonatale ratten en muizen17. Een beperkt aantal studies heeft zich gericht op de zuivering van microglia uit het ruggenmerg van volwassen muizen13,14. Deze technieken omvatten enzymatische vertering met behulp van collagenase en…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door subsidies van de beurs die werd toegekend door de Nationale Raad voor Wetenschap en Technologie (CONACYT) (702361). De auteurs erkennen de Ph.D. programma in Biologische Chemische Wetenschappen van de National School of Biological Sciences van het National Polytechnic Institute.
Materials
| 15 mL collection tubes | Corning, USA | 430790 | |
| 2 mL microtubes | Axygen, USA | MCT-200-G | |
| 2.4G2 anti-FcR | BioLegend, USA | 101302 | |
| 50 mL collection tubes | Corning, USA | 430829 | |
| 70% ethanol | |||
| Antibiotic-Antimycotic (penicillin, streptomycin, amphotericin b) | Gibco, USA | 15240062 | |
| Antibody CD11b eFluor 450 anti-mouse | eBioscience, USA | 48-0112 | |
| Antibody CD45 PerCP anti-mouse | BioLegend, USA | 103130 | |
| Balanced salt solution (PBS) calcium- magnesium-free | Corning, USA | 46-013-CM | |
| Blue Cell Strainer 40 μm | Corning, USA | 352340 | |
| Costar 6-well Clear Not Treated | Corning, USA | CLS3736 | |
| Coverslips | |||
| Digital Heating Shaking Drybath | Thermo Scientific Digital HS Drybath, USA | 88870001 | |
| Dissecting forceps for microsurgery | FT by DUMONT | ||
| DNase | Roche, USA | 4536282001 | |
| Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium-high glucose (DMEM) | Merck, USA | D6429 | |
| Electric shaver | |||
| FACS tube | Thermo, USA | 352058 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | PAN Biotech, Alemania | P30-3306 | |
| Flow cytometer Cytoflex | Beckman Coulter | ||
| Hank’s balanced salt solution | Merck, USA | H2387 | |
| L-glutamine | Corning, USA | 15393631 | |
| Liberase TM | Roche, USA | 5401119001 | |
| Neubauer chamber Counting Chambers | China | 1103 | |
| Pentobarbital | |||
| Percoll | Merck, USA | 17089101 | density gradient centrifugation |
| Poly-L-lysine solution | Merck, USA | P8920 | |
| Scalpel No. 25 | HERGOM, Mexico | H23 | |
| Snaplock Microcentrifuge Tubes 2 mL | Axygen, USA | 10011-680 | |
| Stereoscopic microscope | Velab, Mexico | HG927831 | |
| Straight surgical scissors (10 cm) | HERGOM, Mexico | ||
| Straight Vannas scissors | HERGOM, Mexico | ||
| Triton X100 | Merck, USA | X100 | |
| Trypan blue Stain 0.4% | Merck, USA | 15250-061 | |
| Vortex mixer | DLAB, China | 8031102000 | |
| Zombie Aqua Fixable Viability Kit | BioLegend, USA | 423102 | amine-reactive fluorescent dye staining |
Riferimenti
- Schröder, H., Schröder, , Moser, , Huggenberger, , et al. . Neuroanatomy of the Mouse. , 59-78 (2020).
- Sengul, G., et al. Cytoarchitecture of the spinal cord of the postnatal (P4) mouse. Anat Rec. 295, 837-845 (2012).
- Bab, I., et al. . Microtomographic atlas of the mouse skeleton. VIII, 205 (2007).
- Nayak, D., et al. Microglia development and function. Annu Rev Immunol. 32, 367-402 (2014).
- Martinez, F. O., et al. Macrophage activation and polarization. Front Biosci. 13, 453-461 (2008).
- Masuda, T., et al. Microglia heterogeneity in the single-cell era. Cell Rep. 30 (5), 1271-1281 (2020).
- Prinz, M. Microglia biology: one century of evolving concepts. Cell. 179 (2), 292-311 (2019).
- de Haas, A. H., et al. Region-specific expression of immunoregulatory proteins on microglia in the healthy CNS. Glia. 56 (8), 888-894 (2008).
- Xuan, F. L., et al. Differences of microglia in the brain and the spinal cord. Front Cell Neurosci. 13, 504 (2019).
- Paolicelli, R. Microglia states and nomenclature: A field at its crossroads. Neuron. 110 (21), 3458-3483 (2022).
- Li, Q., et al. Spinal IL-36γ/IL-36R participates in the maintenance of chronic inflammatory pain through astroglial JNK pathway. Glia. 67 (3), 438-451 (2019).
- Prinz, M., et al. Microglia and central nervous system-associated macrophages-from origin to disease modulation. Annu Rev Immunol. 39, 251-277 (2021).
- Yip, P. K., et al. Rapid isolation and culture of primary microglia from adult mouse spinal cord. J Neurosci Methods. 183 (2), 223-237 (2009).
- Akhmetzyanova, E. R., et al. Severity- and time-dependent activation of microglia in spinal cord injury. Int J Mo. Sci. 24 (9), 1-16 (2023).
- Mahadevan, V. Anatomy of the vertebral column. Surgery. 36 (7), 327-332 (2018).
- Krukowski, K., et al. Temporary microglia-depletion after cosmic radiation modifies phagocytic activity and prevents cognitive deficits. Sci Rep. 8 (1), 1-13 (2018).
- Cardona, A., et al. Isolation of murine microglial cells for RNA analysis or flow cytometry. Nat Protoc. 1, 1947-1951 (2006).
- Schmidt, V. M., et al. Comparison of the enzymatic efficiency of Liberase TM and tumor dissociation enzyme: effect on the viability of cells digested from fresh and cryopreserved human ovarian cortex. Reprod Biol Endocrinol. 16 (57), 1-14 (2018).
- Kusminski, C. M., et al. MitoNEET-parkin effects in pancreatic α- and β-cells, cellular survival, and intrainsular cross talk. Diabetes. 65 (6), 1534-1555 (2016).
