마우스 척수 미세아교세포(Mouse Spinal Cord Microglia)의 빠르고 효율적인 농축
Summary
미세아교세포는 신체에서 가장 다재다능한 세포 중 하나로 간주되며, 형태학적, 기능적 적응이 가능합니다. 이들의 이질성과 다기능성은 뇌의 항상성을 유지하는 동시에 다양한 신경학적 병리와 관련이 있습니다. 여기에서는 척수 미세아교세포를 정제하는 기술에 대해 설명한다.
Abstract
척추는 척추동물을 정의하고 척수를 둘러싸고 보호하는 구멍인 척추관을 형성합니다. 포유류 중추신경계의 적절한 발달과 기능은 미세아교세포(microglia)로 알려진 상주 대식세포의 활동에 크게 의존합니다. 미세아교세포는 이질성과 다기능성을 나타내어 척수와 뇌 내에서 뚜렷한 유전자 발현과 행동을 가능하게 합니다. 수많은 연구에서 대뇌 미세아교세포의 기능을 탐구하여 정화 방법을 광범위하게 설명했습니다. 그러나 생쥐의 척수에서 미세아교세포를 정제하는 것은 포괄적인 설명이 부족합니다. 대조적으로, 정제되지 않은 추출물과 달리 고도로 정제된 콜라겐분해효소의 활용은 중추 신경계 조직 내에서보고가 부족합니다. 이 연구에서는 8-10주 된 C57BL/6 마우스에서 척추와 척수를 절제했습니다. 후속 분해는 고도로 정제된 콜라겐분해효소를 사용했고, 미세아교세포 정제는 밀도 구배를 이용했습니다. 세포는 유세포 분석을 위해 염색을 거쳐 CD11b 및 CD45 염색을 통해 생존율과 순도를 평가했습니다. 그 결과 평균 생존율은 80%, 평균 순도는 95%였습니다. 결론적으로, 마우스 미세아교세포의 조작은 고도로 정제된 콜라겐분해효소를 사용한 분해와 밀도 구배를 수반했습니다. 이 접근법은 상당한 척수 미세아교세포 개체군을 효과적으로 생산했습니다.
Introduction
척추 동물의 특징은 척추 기둥 또는 척추이며, 척추 뼈는 척추 디스크로 나뉘어 진 척추 뼈라고 불리는 일련의 분절 된 뼈로 대체되었습니다. 이러한 골성 물질의 연속은 척수를 둘러싸고 보호하는 구멍인 척추관(spinal canal)을 형성한다1. Rodentia 속의 척추는 일반적으로 7 개의 경추, 13 개의 흉추, 6 개의 요추 및 다양한 수의 꼬리 척추 2,3에 의해 형성됩니다. 척수의 길이는 척추의 길이와 비슷하며, 말단 종사는 척수를 천골에 고정하는 비신경 구조입니다. 또한, 신경 섬유는 추간공(intervertebral foramen)을 통해 빠져나간다 1.
포유류에서 중추신경계의 발달과 적절한 기능은 미세아교세포(microglia4)라고 불리는 신경계의 상주 대식세포의 활동에 결정적으로 의존한다. 미세아교세포는 처음에 뇌 상주 식세포로 기술되었지만, 최근 연구는 이러한 세포에 많은 동적 기능을 부여했습니다 5,6. 미세아교세포의 크기는 항상성에서 7-10μm입니다. 그들은 신체에서 가장 다재다능한 세포 중 하나로 간주되며 끊임없이 변화하는 환경에 형태학적으로나 기능적으로 적응할 수 있습니다7. 이들 세포는 배아 단계와 성체 단계 모두에서 높은 이질성을 나타내며8,9 성체 단계에서는 시공간 맥락에 따라 복잡한 기능적 이질성을 나타낸다10. 미세아교세포의 이질성과 다양한 기능은 척수와 뇌에서 유전자 발현과 행동을 다르게 합니다. CD11b, CD45, CD86 및 CCR9 발현은 뇌에 비해 척수에서 더 높은 것으로 나타났습니다 8,9.
대뇌 미세아교세포(cerebral microglia) 분리를 위한 여러 프로토콜이 존재한다11,12; 그러나 척수 미세아교세포(spinal cord microglia)에 대해서는 소수만이 존재한다13,14. 척수에서 미세아교세포를 정제하는 방법을 최적화하면 미세아교세포의 생리학을 발견하는 데 중점을 둔 여러 연구의 개발을 촉진할 수 있습니다. 이 프로토콜은 간단하고 재현성이 높은 쥐 척수 추출과 미세아교세포의 정제를 설명하는 것을 목표로 합니다(그림 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
뇌 항상성에서의 중요성 때문에 미세아교세포 연구를 위해 수많은 프로토콜이 개발되었습니다. 이러한 방법에서, 미세아교세포는 전형적으로 배아 또는 신생아 쥐 및 마우스의 대뇌 반구에서 공급된다17. 제한된 수의 연구가 성체 마우스의 척수에서 미세아교세포의 정제를 다루었다13,14. 이러한 기술에는 DNAse와 함께 콜라겐분해효소 …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 702361(National Council of Science and Technology)에서 수여하는 장학금의 지원으로 이루어졌습니다. 저자는 국립 폴리테크닉 연구소(National Polytechnic Institute)의 국립 생물 과학 학교(National School of Biological Sciences)의 생물 화학 과학 박사 과정을 인정합니다.
Materials
| 15 mL collection tubes | Corning, USA | 430790 | |
| 2 mL microtubes | Axygen, USA | MCT-200-G | |
| 2.4G2 anti-FcR | BioLegend, USA | 101302 | |
| 50 mL collection tubes | Corning, USA | 430829 | |
| 70% ethanol | |||
| Antibiotic-Antimycotic (penicillin, streptomycin, amphotericin b) | Gibco, USA | 15240062 | |
| Antibody CD11b eFluor 450 anti-mouse | eBioscience, USA | 48-0112 | |
| Antibody CD45 PerCP anti-mouse | BioLegend, USA | 103130 | |
| Balanced salt solution (PBS) calcium- magnesium-free | Corning, USA | 46-013-CM | |
| Blue Cell Strainer 40 μm | Corning, USA | 352340 | |
| Costar 6-well Clear Not Treated | Corning, USA | CLS3736 | |
| Coverslips | |||
| Digital Heating Shaking Drybath | Thermo Scientific Digital HS Drybath, USA | 88870001 | |
| Dissecting forceps for microsurgery | FT by DUMONT | ||
| DNase | Roche, USA | 4536282001 | |
| Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium-high glucose (DMEM) | Merck, USA | D6429 | |
| Electric shaver | |||
| FACS tube | Thermo, USA | 352058 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | PAN Biotech, Alemania | P30-3306 | |
| Flow cytometer Cytoflex | Beckman Coulter | ||
| Hank’s balanced salt solution | Merck, USA | H2387 | |
| L-glutamine | Corning, USA | 15393631 | |
| Liberase TM | Roche, USA | 5401119001 | |
| Neubauer chamber Counting Chambers | China | 1103 | |
| Pentobarbital | |||
| Percoll | Merck, USA | 17089101 | density gradient centrifugation |
| Poly-L-lysine solution | Merck, USA | P8920 | |
| Scalpel No. 25 | HERGOM, Mexico | H23 | |
| Snaplock Microcentrifuge Tubes 2 mL | Axygen, USA | 10011-680 | |
| Stereoscopic microscope | Velab, Mexico | HG927831 | |
| Straight surgical scissors (10 cm) | HERGOM, Mexico | ||
| Straight Vannas scissors | HERGOM, Mexico | ||
| Triton X100 | Merck, USA | X100 | |
| Trypan blue Stain 0.4% | Merck, USA | 15250-061 | |
| Vortex mixer | DLAB, China | 8031102000 | |
| Zombie Aqua Fixable Viability Kit | BioLegend, USA | 423102 | amine-reactive fluorescent dye staining |
Riferimenti
- Schröder, H., Schröder, , Moser, , Huggenberger, , et al. . Neuroanatomy of the Mouse. , 59-78 (2020).
- Sengul, G., et al. Cytoarchitecture of the spinal cord of the postnatal (P4) mouse. Anat Rec. 295, 837-845 (2012).
- Bab, I., et al. . Microtomographic atlas of the mouse skeleton. VIII, 205 (2007).
- Nayak, D., et al. Microglia development and function. Annu Rev Immunol. 32, 367-402 (2014).
- Martinez, F. O., et al. Macrophage activation and polarization. Front Biosci. 13, 453-461 (2008).
- Masuda, T., et al. Microglia heterogeneity in the single-cell era. Cell Rep. 30 (5), 1271-1281 (2020).
- Prinz, M. Microglia biology: one century of evolving concepts. Cell. 179 (2), 292-311 (2019).
- de Haas, A. H., et al. Region-specific expression of immunoregulatory proteins on microglia in the healthy CNS. Glia. 56 (8), 888-894 (2008).
- Xuan, F. L., et al. Differences of microglia in the brain and the spinal cord. Front Cell Neurosci. 13, 504 (2019).
- Paolicelli, R. Microglia states and nomenclature: A field at its crossroads. Neuron. 110 (21), 3458-3483 (2022).
- Li, Q., et al. Spinal IL-36γ/IL-36R participates in the maintenance of chronic inflammatory pain through astroglial JNK pathway. Glia. 67 (3), 438-451 (2019).
- Prinz, M., et al. Microglia and central nervous system-associated macrophages-from origin to disease modulation. Annu Rev Immunol. 39, 251-277 (2021).
- Yip, P. K., et al. Rapid isolation and culture of primary microglia from adult mouse spinal cord. J Neurosci Methods. 183 (2), 223-237 (2009).
- Akhmetzyanova, E. R., et al. Severity- and time-dependent activation of microglia in spinal cord injury. Int J Mo. Sci. 24 (9), 1-16 (2023).
- Mahadevan, V. Anatomy of the vertebral column. Surgery. 36 (7), 327-332 (2018).
- Krukowski, K., et al. Temporary microglia-depletion after cosmic radiation modifies phagocytic activity and prevents cognitive deficits. Sci Rep. 8 (1), 1-13 (2018).
- Cardona, A., et al. Isolation of murine microglial cells for RNA analysis or flow cytometry. Nat Protoc. 1, 1947-1951 (2006).
- Schmidt, V. M., et al. Comparison of the enzymatic efficiency of Liberase TM and tumor dissociation enzyme: effect on the viability of cells digested from fresh and cryopreserved human ovarian cortex. Reprod Biol Endocrinol. 16 (57), 1-14 (2018).
- Kusminski, C. M., et al. MitoNEET-parkin effects in pancreatic α- and β-cells, cellular survival, and intrainsular cross talk. Diabetes. 65 (6), 1534-1555 (2016).
