Denne studien presenterer et brukervennlig, komplett og enkelt sett med metoder for å merke og analysere glomeruli fra CUBIC-ryddede musenyrer. Data som glomerulusantall og volum kan oppnås enkelt og pålitelig ved hjelp av fluoresceinisotiocyanat (FITC)-Dextran, lysarkfluorescensmikroskopi (LSFM), eller vanlig konfokalmikroskopi og programvare som Imaris.
Glomeruli er grunnleggende enheter i nyrene; Derfor er studier av glomeruli avgjørende for å forstå nyrefunksjon og patologi. Biologisk avbildning gir intuitiv informasjon; Dermed er det av stor betydning å merke og observere glomeruli. Imidlertid krever glomeruli observasjonsmetoder som er i bruk kompliserte operasjoner, og resultatene kan miste etikettdetaljer eller tredimensjonal (3D) informasjon. Den klare, uhindrede hjerneavbildningscocktailer og beregningsanalyse (CUBIC) vevsfjerningsteknologi har blitt mye brukt i nyreforskning, noe som muliggjør mer nøyaktig deteksjon og dypere deteksjonsdybde. Vi fant at musglomeruli raskt og effektivt kan merkes ved haleveneinjeksjon av middels molekylvekt FITC-Dextran etterfulgt av CUBIC-clearing-metoden. Den ryddede musenyren kunne skannes av et lysarkmikroskop (eller et konfokalmikroskop når det ble skåret) for å oppnå tredimensjonale bildestabler av alle glomeruli i hele nyren. Behandlet med passende programvare, kan glomeruli-signalene enkelt digitaliseres og analyseres videre for å måle antall, volum og frekvens av glomeruli.
Antallet og volumet av glomeruli er svært viktig for diagnostisering og behandling av ulike nyresykdommer 1,2,3,4,5. Den gylne standarden for glomeruli tallestimering er den fysiske dissektor / fraksjonator kombinasjonen. Denne metoden krever imidlertid spesielle reagenser og utstyr, noe som gjør det tregt og dyrt 6,7,8,9. Biopsi gir et vell av informasjon, men åpenbart er denne metoden bare egnet for grove estimater10,11. Medisinsk bildebehandlingsteknologi, inkludert magnetisk resonansavbildning (MRI), computertomografi (CT) og røntgen, er også mye brukt i glomerulær deteksjon 12,13,14,15, men slike teknologier krever store instrumenter. Nye metoder, for eksempel matriseassistert laserdesorpsjon / ionisering (MALDI) bildemassespektrometer16 eller tykk og tynnsnittmetode17, har også blitt brukt i glomerulær deteksjon, selv om de fortsatt er kjedelige og arbeidskrevende.
Ved hjelp av gjennomsiktighetsteknologier er det mulig å observere dypere dybder og få rikere og mer fullstendig informasjon fra tykt vev eller til og med hele organer 18,19,20,21,22,23. Derfor har åpenhetsteknologier blitt mye brukt i nyreforskning24. Observasjon og påvisning av glomeruli i de ryddede nyrene er også involvert. Imidlertid refererte disse publiserte artiklene enten bare kort til glomerulær deteksjon25 eller brukte vanskelige å oppnå merkingsmetoder som transgene dyr26, selvproduserte fargestoffer13 eller høykonsentrasjons antistoffinkubasjon27 for å merke glomeruli. I tillegg, selv om studier hadde analysert glomeruli i klarerte nyrer, var analysene alltid begrenset13 eller støttet seg på analysealgoritmer etablert av forfatterne selv26.
Vi har tidligere vist en mer praktisk måte å merke glomeruli i mus nyrer28. Ved å bruke Imaris fant vi ut at glomeruli-antall, frekvens og volum raskt kunne oppnås. Dermed presenterer vi her et mer tilgjengelig, omfattende og forenklet sett med metoder for å merke og analysere glomeruli av musnyrer.
Tissue-clearing teknologier kan klassifiseres i 3 eller 4 grupper 29,30,31. Organisk løsemiddelbasert vevsfjerning (f.eks. DISCO og PEGASOS), vandig vevsrydding (f.eks. CUBIC) og hydrogelinnebygging av vevsfjerning (f.eks. CLARITY) har alle blitt brukt i nyrerydding 25,26,28,32. CUBIC, som vi har vis…
The authors have nothing to disclose.
Denne studien ble støttet av tilskudd fra National Natural Science Foundation of China (82204951) og Sichuan Science and Technology Program (2020JDRC0102).
4% PFA | Biosharp | 7007171800 | Fixation reaagen |
502 Glue | Deli | 7146 | For fixing the kidney to the sample fixing adapter |
Antipyrine | Aladdin | A110660 | Clearing reagent |
Brain Matrix | RWD Life Science | 1mm 40-75 | Tissue slicing |
Confocal microscopy | Nikon | A1plus | Image acquisition |
FITC-Dextran | Sigma-Aldrich | FD150S | Labeling reagent |
Light sheet fluorescence microscopy | Zeiss | Light sheet 7 | Image acquisition |
Mice | Ensiweier | Adult C57BL/6 mice (6 weeks of age, 25–30 g) | |
N-Butyldiethanolamine | Aladdin | B299095 | Clearing reagent |
Nicotinamide | Aladdin | N105042 | Clearing reagent |
Pentobarbital Natriumsalz | Sigma-Aldrich | P3761 | |
Tail vein fixator | JINUOTAI | JNT-FS35 | Fix the mouse for vail injection |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Clearing reagent |