Summary
Detta protokoll ger ett experimentellt ramverk för att dokumentera den fysiska effekten av cytoskelettet på kärnformen och de inre membranlösa organellerna i musens oocytsystem. Ramverket kan anpassas för användning i andra celltyper och sammanhang.
Abstract
En stor utmaning för att förstå orsakerna till kvinnlig infertilitet är att klarlägga mekanismer som styr utvecklingen av kvinnliga könsceller, så kallade oocyter. Deras utveckling kännetecknas av celltillväxt och efterföljande delningar, två kritiska faser som förbereder oocyten för fusion med spermier för att initiera embryogenes. Under tillväxten omorganiserar oocyter sin cytoplasma för att placera kärnan i cellcentrum, en händelse som förutsäger framgångsrik oocytutveckling hos möss och människor och därmed deras embryogena potential. I musoocyter visade sig denna cytoplasmatiska omorganisation drivas av cytoskelettet, vars aktivitet genererar mekaniska krafter som omrör, ompositionerar och penetrerar kärnan. Följaktligen justerar denna cytoplasmatiska till nukleoplasmatiska kraftöverföring dynamiken hos nukleära RNA-behandlande organeller som kallas biomolekylära kondensat. Detta protokoll tillhandahåller ett experimentellt ramverk för att dokumentera, med hög tidsupplösning, cytoskelettets inverkan på kärnan över rumsliga skalor i musoocyter. Den beskriver de avbildnings- och bildanalyssteg och verktyg som är nödvändiga för att utvärdera i) cytoskelettaktivitet i oocytcytoplasman, ii) cytoskelettbaserad omrörning av oocytkärnan och iii) dess effekter på biomolekylär kondensatdynamik i oocytens nukleoplasma. Utöver oocytbiologi kan de metoder som utvecklas här anpassas för användning i somatiska celler för att på liknande sätt ta itu med cytoskelettbaserad justering av kärndynamik över skalor.
Introduction
Nukleär positionering är avgörande för flera cellulära och utvecklingsfunktioner 1,2,3,4,5. Däggdjurshonornas könsceller som kallas oocyter omformar sin cytoplasma för att placera kärnan i cellcentret trots att de genomgår en asymmetrisk delning i storlek, vilket beror på efterföljande kromosomförskjutning6 (figur 1). Denna centrering av kärnan förutsäger framgångsrik oocytutveckling hos möss och människor 7,8, och därmed deras embryogena potential (Figur 1).
Cytoplasmatisk remodellering i musoocyter drivs främst av aktomyosincytoskelettet9 (figur 2). Dess aktivitet genererar mekaniska krafter som rör om, ompositionerar och penetrerar kärnan10 (figur 2). Följaktligen justerar denna cytoplasmatiska till nukleoplasmatiska kraftöverföring dynamiken hos nukleära budbärar-RNA-bearbetande organeller som kallas kärnfläckar11, en av flera membranlösa organeller i kärnan som kallas biomolekylära kondensat 12,13,14,15,16 (Figur 2).
Levande bilder har varit avgörande för att dechiffrera de funktionella konsekvenserna av nukleär omrörning. Filmer av nukleär migration under timmar, såväl som högupplösta filmer av aktinnätet och bulkcytoplasman, bidrog till stor del till utarbetandet av en teoretisk modell för nukleär positionering, som kopplar samman olika tidsskalor9. Filmer med hög tidsupplösning av cytoplasman, kärnkonturen och kärnkomponenter såsom kromatin och kärnkondensat, belyste också rollen av cytoskelettbaserad omrörning av kärnan på RNA-bearbetning och genuttryck i musoocyter, vilket överbryggar olika spatiotemporala skalor inom cellen10,11. Sammantaget gav ett sådant skalöverskridande tillvägagångssätt baserat på live-avbildning den första logiska grunden som kopplade cytoskelettagitation av kärnan till oocyternas utvecklingsframgång.
Protokollet tillhandahåller den pipeline för avbildning och bildanalys som används för att studera överföringen av cytoplasmatiska krafter (som främst genereras av F-aktin och delvis av mikrotubuli) till kärnan och dess interna komponenter i musoocyter. Resultatet av dessa experiment är att fånga kontinuum av krafter över rumsliga skalor, från cytoskelettet i cytoplasman till kärnans inre via filmer med hög tidsupplösning som visas i två nyligen genomförda studier10,11, som fastställde kopplingen mellan cytoplasmatiska aktiva rörelser, fluktuationer i kärnkonturen, såväl som rörelse och ytfluktuationer hos en enda typ av nukleära biomolekylära kondensat: nukleära fläckar. Samma tillvägagångssätt kan tillämpas på andra modellsystem där cytoplasmatiska krafter förväntas förändras, till exempel i samband med maligna cancerceller17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök utfördes i enlighet med Europeiska gemenskapens riktlinjer och godkändes av det franska jordbruksministeriet (tillstånd nr 75-1170) och av Direction Générale de la Recherche et de l'Innovation (DGRI; GMO-avtal nummer DUO-5291). Mössen inhystes i djuranläggningen under en 12 timmars ljus/mörker-cykel, med en omgivningstemperatur på 22-24 °C och en luftfuktighet på 40-50 %. Möss som används här inkluderar hona OF1 (Oncins France 1, 8 till 12 veckor gammal) och hona C57BL/6 (10 till 14 veckor gammal).
1. Insamling och beredning av oocyter
- Samla in oocyter från 8 till 14 veckor gamla möss enligt beskrivningen i18 och19.
- Kortfattat, extrahera först äggstockar från möss som i18 till förvärmt (37 °C) M2 + Bovine Serum Albumin (BSA) medium kompletterat med 1 μM Milrinone19, vilket förhindrar att meiosen återupptas i oocyter.
- Punktera äggstocksfolliklar med kirurgiska nålar för att frigöra växande oocyter från antrala folliklar (slutet av oocyttillväxten20).
- Samla in oocyter av den storlek som behövs för experiment (växande och/eller fullvuxna oocyter) med en mikropipett som är specialiserad för uppsamling av oocyter, innan du tvättar dem och lägger dem i disken med färskt medium under mineralolja.
- Separera oocyter mekaniskt från antrala follikelceller genom pipettering upp och ner och låt stabilisera i 1 timme i inkubatorn vid 37 °C innan efterföljande experimentella steg fortsätter.
OBS: Oocyterna hålls vid 37 °C under alla experimentella steg. För detta protokoll samlades de största oocyterna, som är de fullvuxna, in.
2. Mikroinjektion av äggceller
OBS: För att fånga cytoskelettbaserad aktivitet i cytoplasman används ljusfältsavbildning. Mikroinjektion av fluorescerande markörer är därför inte nödvändig, och protokollet kan återupptas i steg 3. För att avbilda den nukleära konturen användes Rango, en sond som visade YFP-taggen vid dess N-ändstation och en CFP-tagg vid dess C-terminal21,22. När den avbildas i oocyter vid 488 nm märker den hela kärnan, förutom nukleolen23, och visar en mycket skarp kärnkontur. För att visualisera nukleära fläckar användes SRSF2-GFP (NM_011358), en markör för kärnfläckar11. Samma medium används för insamling av oocyter, mikroinjektion, komplementär RNA-translation och avbildning av levande celler.
- Linjärisera Rango-plasmiden med SfiI- eller SRSF2-GFP-plasmid med AgeI-restriktionsenzymer.
- Syntetisera täckta komplementära RNA (cRNA) med lämpligt in vitro-transkriptionskit enligt promotorn (T3 för Rango och T7 för SRSF2-GFP) och rena dem med hjälp av ett kolonnreningskit, som tidigare beskrivits24.
OBS: Polyadenylat SRSF2-GFP RNA med hjälp av ett polyadenyleringskit för att öka cRNA-stabiliteten. Två olika promotorer används på grund av skillnader i plasmidryggraden. - Mät cRNA-koncentrationer med en mikrovolymspektrofotometer.
- Späd Rango cRNA till 1000 ng/μL och SRSF2-GFP cRNA till 600 ng/μL i dH2O.
- Centrifugera cRNA-alikvoten vid 4 °C i minst 60 minuter vid 25 000 x g före mikroinjektion.
- Injicera cRNA som kodar för YFP-Rango eller SRSF2-GFP enligt beskrivningen iavsnitt 11,25 i cytoplasman hos oocyter i 37 °C M2+ BSA+Milrinon-medium med hjälp av en mikroinjektor.
- Inkubera oocyterna i minst 2 timmar i odlingsmedium vid 37 °C för cRNA-translation.
- Deponera oocyterna i små (5 μL) medelstora odlingsdroppar på en 35 mm vävnadsodlingsskål med täckglasbotten täckt med mineralolja. Placera en oocyt per droppe för att undvika fotoblekning av intilliggande oocyter.
3. Avbildning av levande celler
OBS: Levande musoocyter undersöktes med ett inverterat konfokalmikroskop utrustat med ett Plan-APO 40x/1.25 NA-oljenedsänkningsobjektiv, ett motoriserat skanningsdäck, en inkubationskammare (37 °C), en CCD-kamera kopplad till ett filterhjul och en snurrande skiva. Bilder med hög tidsupplösning tas med hjälp av Metamorph (hädanefter kallad bildbehandlingsprogrammet) i ströminsamlingsläge.
- Öppna fönstret Hämta i bildbehandlingsprogrammet.
- Ställ in exponeringstiden på 500 ms, kameraområdet på Full Chip och binning på 1.
- På fliken Acquire ställer du in belysningen för önskad kanal. För att avbilda cytoplasmatisk aktivitet, belysa oocyter med överfört ljus. För att avbilda kärnan märkt med YFP-Rango eller SRSF2-GFP, belysa oocyter med en excitationsvåglängd på 491 nm.
- För cytoplasmatisk omrörning eller YFP-Rango-experiment, fokusera på oocytnukleolen som lätt kan observeras med genomsläppligt ljus (Figur 3A). Ett enda plan kommer att anskaffas. För experiment med kärnfläckar, fokusera på SRSF2-GFP-droppar (figur 3C).
- På fliken Special ställer du in parametrar för att optimera förvärvshastigheten enligt nedan.
Kamerans slutare: Öppna för exponering
Rensa läge: RENSA FÖRSEKVENS - Öppna fönstret Stream Acquisition i bildbehandlingsprogrammet. Ange strömningsparametrarna enligt experimentet. För båda studierna 10,11 används de parametrar som beskrivs nedan.
- På fliken Hämta anger du följande parametrar.
Förvärvsläge: Strömma till RAM
Antal bilder: 480 (kan minskas till 240 bilder för att minska bildtiden)
Kameraparametrar: Ta bilder med bildhastighet
Antal (Nb) bildrutor som ska hoppas över: 0 - På fliken Parametrar för digitalkamerastyrenhet ställer du in följande parametrar.
Kameratillstånd: HALT
Slutarläge: ÖPPNA ALDRIG
Rensa läge: RENSA FÖRSEKVENS
Antal bildrutor i förhållande till medelvärde: 1
OBS 1: I Stream-läge, när exponeringstiden är inställd, bestäms filmens längd av antalet bildrutor. Till exempel genererar 500 ms exponeringstid och 480 bildrutor en film på 4 minuter. En förhandsgranskning kan visas under bildtagningen.
- På fliken Hämta anger du följande parametrar.
- Justera ett intresseområde (ROI) runt objektet. Att minimera ROI-arean minskar förvärvstiden.
- Klicka på Acquire (Förvärva) i fönstret Stream Acquisition (Hämta ström) för att starta filmen.
- Spara filmen som en .tif fil i slutet av hämtningen.
OBS: För att följa kärnstrukturer under filmer med hög tidsupplösning bör kärnsonder (YFP-Rango och SRSF2-GFP) ha ett högt signal-brusförhållande för att underlätta segmentering av objekten under ytterligare steg i bildanalysen. Exogena SRSF2-GFP-uttrycksprofiler bör vara jämförbara med endogena kärnspeckelimmunfärgningar (Figur 3C-D). Förändringar i SRSF2-GFP-uttrycksprofiler i förhållande till endogen färgning kan återspegla höga doser av cRNA-injektion och translation26 (Figur 3C-D).
4. Bildanalys: Cytoplasmatisk omrörning
OBS: Den cytoplasmatiska omrörningen som återspeglar intensiteten av aktinbaserad cytoskelettaktivitet i oocyter bestäms genom bildkorrelationsanalyser med hjälp av en programvara från en tidigare publikation från labbet9 och tillgänglig på27. Programvaran mäter hur mycket pixelintensitet som bevaras mellan på varandra följande bilder. Utdata är förlusten av korrelation mellan bilder i tid, som börjar vid 1 och minskar exponentiellt med tiden, som i9.
- Justera råa timelapse-bilder (Δt = 0,5 s) med hjälp av Fiji StackReg-plugin-programmet (Plugins>StackReg). Om du vill installera plugin-programmet StackReg28 aktiverar du BIG-EPFL-uppdateringswebbplatsen29 för att få åtkomst till plugin-programmet.
- Beräkna ljusfältskorrelationer i 3 till 4 cytoplasmatiska regioner på ~300 μm2 genom att följa stegen nedan.
- Beskär regionerna och spara dem som separata filmfiler. Öppna terminalfönstret.
- Skriv oocyte, tryck på mellanslagstangenten och tryck sedan på Retur. Ett fönster som heter Signal och Slot visas. Välj de beskurna filmfiler som ska analyseras.
OBS: Flera filmer kan väljas samtidigt.
- Programmet returnerar filer i samma mapp som filmerna. Tre olika filer med .csv, .eps och .xls tillägg genereras. Den .xls filen innehåller data för att rita korrelationsdiagrammen för en region. Genomsnittliga korrelationsvärden från olika regioner i en cell.
- För visuell tydlighet kan du transformera de slutliga korrelationsvärdena genom att subtrahera värdet för varje tidpunkt från 1 för att få en inverterad exponentialliknande kurva som i 11.
5. Bildanalys: Cytoplasmatiska vektorkartor
OBS: Cytoplasmatiska vektorkartor för musoocyter genererades av Spatiotemporal Image Correlation Spectroscopy (STICS) plugin30 som tidigare implementerats för att detektera cytoplasmatiska flöden i musoocyter31 på Fiji 32 och tillgänglig på 33. Kartorna visar cytoplasmatisk flödeshastighet, storlek och riktning, som i9 och11.
- Konvertera timelapse-bilder med ljusfält (Δt=0,5 s) till 32-bitarsformat.
- Justera om bilder med Fiji StackReg-plugin-programmet i Plugin-program > StackReg och välj Rigid Body-transformering .
- Med plugin-stacken subtrahera glidande medelvärde jru v2 (i Detrend-verktyg i STICS-plugins-sviten) kan du ta bort stationära strukturer i filmen genom att subtrahera den tidsgenomsnittliga bilden av filmen. Kryssrutorna Subtrahera statiskt medelvärde och Utdataunderstack, välj Behåll rumsligt medelvärde och ange period på 5.
- Rita en ROI runt äggcellen, exklusive cortex för att undvika kanteffekter av pluginet.
- Starta plugin-programmet STICS-karta jru V2 (i ICS-verktyg), med en underregionstorlek på 32 pixlar, en stegstorlek på 16 pixlar, en STICS-tidsförskjutning på 3, X- och Y-förskjutningar på 0, en hastighetsmultiplikator på 8, en storlekströskel på 0 och kryssrutor för Normalisera vektorlängd, Mittvektorer, Utmatningshastigheter och Använd filmmask.
OBS: Insticksprogrammet genererar en karta över oocyten i .tif format, som visar cytoplasmatiska flöden som vektorer med färger som indikerar flödesamplituder, som i9 och11, och en excel-fil med uppmätta flödeshastigheter.
6. Bildanalys: Fluktuationer i nukleära konturer
OBS: Kärnkonturfluktuationer som återspeglar kärnmembranomrörning kan bestämmas från filmer av kärnor märkta med YFP-Rango (Figur 4A,C). Bildanalys för nukleära konturfluktuationer kräver Fiji och installation av plugins StackReg (aktivera BIG-EPFL-uppdateringssidan29 för att få tillgång till StackReg-plugin), PureDenoise34 och Ovocyte_nucleus. StackReg-plugin-programmet utför bildregistrering för att korrigera för eventuell global rörelse. PureDenoise-pluginet tar bort brus från flerdimensionella bilder som skadats av blandat Poisson-Gaussian-brus och jämnar ut kärnkonturen. Det Ovocyte_nucleus plugin-programmet trösklar signalen och fyller hålet som motsvarar nukleolen för att skapa en binär kärnmask, justera den med StackRreg och beräkna avståndet r från kärnmaskens centroid till maskens omkrets för alla θ-vinklar (θ° från 0° till 360° i steg), som i figur 4. Alla koder för dessa plugins finns på 35.
- På Fiji går du till menyn Plugins > CIRB > Verlhac och väljer Ovocyte Nucleus Shape.
- Gör följande val i dialogrutan.
- Välj den mapp som innehåller filmerna som ska analyseras.
- Välj θ-vinkeln (ett värde från 1° till 360° kan väljas och ett värde på 1° användes för optimal konturupplösning), marginalerna för beskärning (5 μm rekommenderas för att behålla hela kärnan).
- Välj XY-kalibrering och tidsintervall. Klicka på OK.
OBS: Resultaten visas som .xls filer i en utmapp i mappen som innehåller originalfilmerna. Denna file visar alla uppmätta radier r för varje gång t och varje vinkel θ. Ett exempel på utdatafil finns i tilläggstabell 1. Mappen out innehåller också en film av kärnmasken.
- Använd ett kalkylblad för att beräkna medelradien R över alla tidpunkter t för varje definierad θ-vinkel. Detta gör det möjligt att plotta medelformen över tid (figur 4B). Se exempel i tilläggstabell 2.
- För varje t och θ subtraheras medelradien R över tiden från radien r. Variansen (r-R)2 är ett mått på fluktuationer i kärnhöljet.
- Beräkna medelvärdet av fluktuationerna för alla tidpunkter t och alla vinklar θ för varje kärna och så småningom för alla kärnor från ett tillstånd.
OBS: När formen på kärnorna förändras väsentligt, som i fallet med ett avbrutet cytoskelett, roteras kärnor märkta med YFP-Rango på Fiji för att orientera den släta delen uppåt och invaginationen nedåt, innan man fortsätter med analys av nukleära konturfluktuationer, som i10.
7. Bildanalys: Kärnspeckelrörelser (diffusiv dynamik)
OBS: Analys av kärnfläckrörelser gör det möjligt att härleda typen av dynamik (driven, diffusiv eller begränsad) hos dessa organeller från deras spår.
- Välj bilder i strömläge av oocyter som uttrycker SRSF2-GFP-droppar som huvudsakligen rör sig i X-Y-axeln.
- Korrekt för blekning av time-lapse-bilder av oocyter som uttrycker SRSF2-GFP med hjälp av histogrammatchningsmetoden i Fiji (Bild > Justera > Blekningskorrigering).
- Justera om bilder med plugin-programmet Fiji StackReg.
- Spåra SRSF2-GFP-dropletcenter med hjälp av Fijis plugin för manuell spårning (plugins > spårning > manuell spårning). Tryck på Lägg till spår för att starta spårning och tryck på Avsluta spår när du är klar. Aktivera inte centreringskorrigering.
- Kopiera spår till en kalkylbladsfil för att fortsätta med beräkningar av temporala medelkvadratförskjutningar (MSD) som i 11, och beräkna temporala MSD från varje 20 s droppbanor.
- Anpassa kurvor (msd(t) = beta x tα) med Nelder-Mead-metoden med hjälp av R-programvara för att uppskatta diffusionsexponenten alfa (α).
- Mät den effektiva diffusionskoefficienten för att kunna jämföra de olika betingelserna eftersom diffusionen förväntas vara avvikande (α< 1).
- Beräkna den effektiva diffusionskoefficienten Deff från en linjär anpassning (alfa=1) på de 40 första punkterna (20 s) i den temporala MSD-kurvan och normalisera med hjälp av droppstorlek (Deff i μm2/s x 3/2 πr i μm).
8. Bildanalys: Fluktuationer på kärnfläckens yta
OBS: Kärnspeckelkonturens utveckling i tid, en avläsning av aktiv kraftöverföring på dessa organeller, mättes med en specialbyggd plugin Radioak36 för användning i Fiji och tillgänglig på37. Insticksprogrammet extraherar värdena för radier för en given markering för alla vinklar runt markeringscentret. Formvariationen över tid mättes genom att jämföra värdet på radien i förhållande till dess medelvärde för varje vinkel. Pluginet gör det möjligt att kvantifiera formfluktuationerna och erbjuder ett alternativ för att visualisera denna dynamik. För att installera den, ladda ner Radioak_.jar-filen och placera den i plugins-mappen på Fiji. Starta om Fiji. Detta insticksprogram är en uppdaterad version av insticksprogrammet som används för att analysera fluktuationer i nukleära konturer ovan och implementera en jämförbar pipeline.
- I strömfilmer av SRSF2-GFP-droppar, välj större droppar av jämförbar storlek (radie ~2.5 μm).
OBS: Om dropparna är för små kommer otillräcklig upplösning att leda till avvikande ytfluktuationsmätningar. - Beskär timelapse-bilder av droppar som sträcker sig över 15 s (Δt = 0,5 s) genom att rita en rektangel runt droppen och välja Bild > beskär (Bild beskär (figur 5).
- Justera om bilder med Fiji StackReg-plugin-programmet i Plugin-program > StackReg och välj Rigid Body-transformering .
- Jämna ut bilden för att ta bort brus runt droppen med alternativet Fiji Smoothen under Process.
- Skapa binär droppmask med alternativet Konvertera till mask i Fiji under Bearbeta > binär. Använd standardmetoden och Mörk som bakgrund (bild 5).
- Analysera den genererade binära droppmasken med alternativet Analysera partiklar i Fiji under Analysera, välj alternativen Rensa resultat och Lägg till i chef och spara intresseområdet (ROI) i RoiManager (Mer > Spara) i zip-format för att läsas av Radioak. ROI:erna måste sparas i en mapp som heter konturer i samma mapp i filmerna, i filer som heter imagename_UnetCortex.zip för att varje film ska hittas av Radioak.
- I Fiji Plugins > CIRB > Radioak-menyn väljer du antingen Hämta radier för att bara bearbeta en film eller Gör en mapp för att analysera alla filmer i samma mapp.
OBS: Ett fönster dyker upp för att välja vinkelnummer och skala. Radioak lanserades i steg om 1° vinkel från 0° till 360° (inmatning på 360) och radievärdena extraherades. - Välj den film eller mapp som innehåller de filmer som ska analyseras. Resultaten tillhandahålls som .xls filer (en för varje film) i en radioakres-katalog i mappen som innehåller originalfilmerna. Varje fil visar alla uppmätta radier r (i μm om skalparametern var ifylld) för varje gång t (i segment) och varje vinkel (i radianer; Figur 5; se exempel på .xls produktion i tilläggstabell 3).
- I kalkylbladet beräknar du medelradien R över alla tidpunkter t för varje definierad vinkel (se exempel i tilläggstabell 4). Detta gör det möjligt att plotta medelformen över tid.
- Plotta variansen (r-R)2 i μm2 som motsvarar måttet på droppytans fluktuationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bildpanelerna i figur 3 visar exempel på en typisk fullvuxen oocyt (figur 3A), nukleoplasman i en fullvuxen oocyt som uttrycker YFP-Rango (figur 3B), nukleoplasman i en fullvuxen oocyt som uttrycker en korrekt (vänster panel; Figur 3C) eller en överdriven (höger panel; Figur 3C) dos av SRSF2-GFP cRNA och en immunfärgning av kärnfläckar i en fullvuxen oocyt med användning av SC35-antikroppen (figur 3D). Den korrekta dosen av SRSF2-GFP cRNA till mikroinjektion definierades baserat på visuella jämförelser mellan uttrycksprofiler för SRSF2-GFP och endogena profiler av kärnfläckar.
Cytoplasmatiska omrörningskrafter i oocyter, som visats av tidigare arbete från laboratoriet med hjälp av STICS-vektorkartor och bildkorrelationsanalys (se9 och11), kan minskas genom cytoskelettstörningar, både genetiska (t.ex. FMN2-mutanta mus) och kemiska (t.ex. Cytochalasin D). STICS-kartor över kontrolloocyter visar många vektorer, med färger som indikerar höga flödeshastigheter, medan kartor över oocyter med störda cytoskelettkrafter visar färre vektorer, med färger som indikerar låga flödeshastigheter. På samma sätt förloras bildkorrelationen mycket snabbt i kontrolloocyter jämfört med oocyter med störda cytoskelettkrafter. Detta kan observeras på korrelationskurvor, med en snabbare minskning av kurvan för kontrolloocyter jämfört med oocyter med störda cytoskelettkrafter9 eller en snabbare ökning när kurvan är inverterad11.
Cytoskelettkrafter rör om kärnan och dess inre organeller, i synnerhet kärnkondensat som kärnfläckar10,11. I figur 4A utsätts kärnan av kontrolloocyter för viktiga perifera fluktuationer, vilket är synligt med hjälp av kärnsonden YFP-Rango. Kärnformen i oocyter med störda cytoskelettkrafter är stabil över tid (Figur 4C). Analys av nukleära konturfluktuationer är nyckeln till att exakt kvantifiera agitationen. Genom att bestämma variansen av avståndet från kärnans centroid till dess periferi, (r-R)2 (Figur 4B), kunde fluktuationer kvantifieras, vilket visar att nukleär omrörning är 6 gånger högre i kontrolloocyter än i oocyter med störda cytoskelettkrafter10. I figur 5A-B visas kärnfläckar (SRSF2-GFP+-droppar) i kontrollerade och störda sammanhang av cytoplasmatiska krafter med hög tidsupplösning. I kontroller fluktuerar droppytan betydligt mer än droppytor i oocyter med störda cytoplasmatiska krafter, vilket kan visualiseras och kvantifieras med hjälp av Radioak32-pluginet. Visuellt indikerar gröna och röda färger (Radioak-utgång som ses på de nedre bilderna i figur 5A-B) vinklar där plugin-programmet detekterade ytförändringar mellan på varandra följande bilder och vitt indikerar brist på ytförändringar.
Figur 1: Illustration av sen musoogenes och tidig embryogenes. Illustration av kärncentrering som sker i sen oocyttillväxt, kromosomförskjutning som sker under oocytdelning och tidiga steg (1-cells- och 2-cellsstadier) av embryogenes. De kvinnliga genomen (oocytkärnan och den kvinnliga kärnan) är i rosa, den manliga kärnan är i blått. Embryokärnorna (efter sammansmältning av föräldrarnas genom) är lila. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Illustration av cytoplasmatisk och nukleär remodellering över skalor i växande musoocyter. Denna figur sammanfattar de viktigaste resultaten från 9,10,11. Illustration av aktomyosinbaserad ombyggnad av cytoplasman, nukleär omrörning och funktionell nukleär biomolekylär kondensatremodellering över spatiotemporala skalor. Den skalkorsande ombyggnaden av kärnfläckar förbättrar biomolekylära reaktioner associerade med deras funktion (dvs. splitsning av pre-mRNA). Observera att detta protokoll endast tillåter bedömning av nukleär omrörning över rumsliga skalor men inte tidsmässiga, eftersom all avbildning görs med samma tidsupplösning på 0,5 s mellan bildramarna. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Provbilder av den fullvuxna oocyten och nukleoplasman. (A) Ljusfältsbild av en fullvuxen oocyt som visar kromatin (cyan) som omger nukleolen. En prickig vit cirkel avgränsar kärnan. B) Levande oocytkärna som uttrycker YFP-Rango. Notera frånvaron av fluorescens i nukleolen. (C) Exempel på levande oocytkärna som uttrycker SRSF2-GFP efter mikroinjektion av korrekta doser av cRNA (vänster panel) eller höga doser av cRNA (höger panel); Notera de kondenserade (dropparna) och upplösta faserna till vänster och deras frånvaro i tillståndet till höger. D) Immunfärgning av kärnfläckar i en fixerad oocyt. notera den endogena uttrycksprofilen som är jämförbar med den i C (vänster panel). Skalstaplar = 5 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Insticksutdata för kontroll och störda nukleära konturfluktuationer. (A) Time-lapse av en kontrolloocytkärna som uttrycker YFP-Rango (överst) och dess motsvarande binära mask genererad av Ovocyte_nucleus plugin (nederst). (B) Principen för mätningar av konturfluktuationer i kärnkontur över tid och i en given riktning. Riktningarna definieras av en vridningsvinkel θ i steg om 1° från 0° till 360°. Två representativa former vid t = 0 s (gul) och t = 135 s (lila) är representerade. Den blå formen motsvarar medelformen över tid. (C) Kärnkonturfluktuationer av en kärna i en oocyt med minskade cytoskelettkrafter på grund av störning av både F-aktin (FMN2-mutant mus) och mikrotubuli (Nocodazol-behandling; som i10). Skalstaplar = 5 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Insticksmodulsutgångar för kontroll och störda droppytfluktuationer. (A) Beskärning av en kontroll-SRSF2-GFP-nukleär droppe avbildad med 500 ms per bildruta och visad i Ice Look Up Table (LUT) (överst); binär mask av samma droppe genererad av Fiji (mitten); och Radioak-plugin-utgångar efter analys av ytfluktuationer hos droppen (nederst), med gröna och röda indikerande vinklar där plugin-programmet detekterade ytförändringar mellan på varandra följande bilder och vitt indikerar brist på ytförändringar. (B) Ytfluktuationer av en kärndroppe i oocyter med minskade cytoskelettkrafter på grund av störning av både F-aktin och mikrotubuli (som i11). Skalstaplar = 5 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Tilläggstabell 1: Exempel på Ovocyte_nucleus plugin-analysutdata. Samma kärna analyserad som den som visas i figur 4A. Theta (θ) är vinkeln i grader och t1 till t600 motsvarar ramnumret, som kan konverteras i tid. Radierna är i μm. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Tilläggstabell 2: Exempel på kalkylblad som används för att beräkna konturfluktuationer i kärnkraften. Samma kärna analyserad som den som visas i figur 4A. Theta (θ) är vinkeln i grader och t1 till t600 motsvarar ramnumret, som kan konverteras i tid. Tabb Rå och medelvärde: Radierna är i μm. Tabb r-R: R-R-avstånden är i μm. Tabell (r-R)2: Fluktuationsvärdena anges i μm2. Flikarna x och y motsvarar de kartesiska koordinaterna för radierna på fliken Rå och medelvärde. De gör det möjligt att rita kärnans medelform över tid på fliken medelform. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Tilläggstabell 3: Exempel på analysresultat från radioak-insticksprogrammet. Samma droppe analyserad som den som visas i figur 5A. De uppmätta radierna vid distinkta tidpunkter och vinklar visas. Radierna är i μm. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Tilläggstabell 4: Exempel på kalkylblad som används för att beräkna fluktuationer i kärndropparnas yta. Samma droppe analyserad som den som visas i figur 5A. Theta (θ) är vinkeln i grader och t1 till t600 motsvarar ramnumret, som kan konverteras i tid. Tabb Rå och medelvärde: Radierna är i μm. Tabb r-R: R-R-avstånden är i μm. Tabell (r-R)2: Fluktuationsvärdena anges i μm2. Flikarna x och y motsvarar de kartesiska koordinaterna för radierna från fliken Rå och medelvärde. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Viktiga steg i detta protokoll inkluderar korrekt mikroinjektion av oocyter utan att påverka deras överlevnad eller normala funktion 9,10,11, samt mikroinjicering av fördefinierade mängder cRNA som skulle möjliggöra korrekt visualisering av relevanta strukturer, som kärnfläckar.
Att fastställa kopplingen mellan cytoplasmatisk och (intra)nukleär dynamik är viktigt när man studerar hur cytoskelettet rör om kärnan eller dess inre. Detta protokoll, med smärre modifikationer, tillåter detta genom att korrelera cytoplasmatiska omrörningsintensiteter till nukleär YFP-Rango eller SRSF2-GFP-droppdynamik (som i11). För att gå vidare bör oocyter först filmas i 120 sekunder i ljusfältsläge för att fånga cytoplasmatisk omrörning, innan de omedelbart filmas i 120 sekunder med en 491 nm laser för att fånga kärnkonturer eller droppdynamik. När det gäller nukleära SRSF2-GFP-droppar kan korrelationen helt enkelt bedömas genom att jämföra deras effektiva diffusionskoefficienter (se steg 7 i detta protokoll) med de inverterade maximala intensitetsvärdena för cytoplasmatisk omrörning som erhållits med hjälp av bildkorrelationsanalyser (se steg 4 i detta protokoll). En annan viktig punkt är storleken på kondensat som väljs för analys av droppytans fluktuationer. Droppar med liknande diameter bör väljas ut för jämförande analyser för att förhindra bias, eftersom storleken modulerar intensiteten av ytfluktuationer.
Det finns vissa begränsningar för det här protokollet. Analyser av fluktuationer i nukleära konturer är beroende av fullständig intranukleär färgning, såsom YFP-Rango eller NLS-GFP. För analyser av kärnfläckar kan mikroinjektion av för stora mängder SRSF2-GFP cRNA leda till uppenbara förändringar i fasseparerande egenskaper hos denna kondensatmarkör (figur 3C), som tidigare granskats av andra26. Det är därför viktigt att verifiera att exogena proteinuttrycksprofiler är jämförbara med de endogena. Dessutom bör relativt små droppar (<2 μm radie) uteslutas från rörledningar för analys av ytfluktuationer på grund av begränsningar i den rumsliga upplösningen med de verktyg som definieras här. Detta upplösningsproblem kan vanligtvis lösas genom användning av mer upplösande mikroskop som till exempel kan vara nödvändiga för att undersöka ytfluktuationer av mindre kondensat i oocytkärnan eller i den betydligt mindre kärnan i somatiska celler.
Sammantaget tillåter detta protokoll fångst av aktin och mikrotubuli cytoskelettbaserad agitation av musens oocytkärna över skalor. Specifikt möjliggör det dokumentation av cytoskelettbaserad mobilisering av cytoplasman, nukleära konturfluktuationer, tillsammans med vätskeliknande kärnfläcksförskjutningar och ytfluktuationer. Även om vissa studier i andra celltyper tar upp några av dessa frågor 38,39,40 via distinkta protokoll av varierande komplexitet på individuella rumsliga skalor, ger detta enkla protokoll de verktyg som krävs för att ta itu med den nämnda cellulära dynamiken över flera skalor i en enda arbetspipeline för första gången. Dessutom möjliggör data som genereras från detta tillvägagångssätt, när de kompletteras med biofysisk modellering som i10,11, en minimalt invasiv utvärdering av: i) förändringar i kärnmekanik10; ii) överföring av cytoskelettbaserade aktiva krafter i cytoplasman till kondensat i kärnan11; och iii) avledningen av denna aktiva energi över olika cellulära fack10,11. Viktigt är att detta protokoll är mångsidigt, eftersom det kan anpassas inte bara till andra kärnkondensat som nukleolen23, utan också till andra celltyper som cancerceller, där förändringar i både cytoskelett- och kärnkondensatbeteenden dokumenterades 17,41.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna redovisar inga motstridiga intressen.
Acknowledgments
A.A.J. och M.A. skrev manuskriptet tillsammans och alla medförfattare kommenterade manuskriptet. M.A. stöds av CNRS och "Projet Fondation ARC" (PJA2022070005322).A.A.J. stöds av Fondation des Treilles, Fonds Saint-Michel och Fondation du Collège de France.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A3311 | |
| CSU-X1-M1 spinning disk | Yokogawa | ||
| DMI6000B microscope | Leica | ||
| Femtojet microinjector | Eppendorf | ||
| Fiji | |||
| Filter wheel | Sutter Instruments Roper Scientific | ||
| Fluorodish | World Precision Instruments | FD35-100 | |
| Metamorph software | Universal Imaging, | version 7.7.9.0 | |
| Mineral oil | Sigma Aldrich | M8410-1L | |
| NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | ||
| OF1 and C57BL/6 mice | Charles River Laboratories | ||
| Poly(A) Tailing kit | Thermo Fisher | AM1350 | |
| Retiga 3 CCD camera | QImaging | ||
| RNAeasy kit | Qiagen | 74104 | |
| SC35 antibody | Abcam | ab11826 | Nuclear speckle antibody; mouse IgG1 anti-SRSF2/SC35 (1:400) |
| SRSF2-GFP plasmid | OriGene Technologies | MG202528 | NM_011358 |
| Stripper Micropipette | XLAB Solutions | specialized for oocyte collection | |
| T3 mMessage mMachine | Thermo Fisher | AM1384 | |
| T7 mMessage mMachine | Thermo Fisher | AM13344 | |
| Thermostatic chamber | Life Imaging Service | ||
| Windows Excel | Windows |
References
- Quinlan, M. E.
- Goldstein, R. E., van de Meent, J. W. A physical perspective on cytoplasmic streaming. Interface Focus. 5 (4), 20150030 (2015).
- Gundersen, G. G., Worman, H. J.
- Metzger, T. MAP and kinesin-dependent nuclear positioning is required for skeletal muscle function. Nature. 484 (7392), 120-124 (2012).
- Roman, W. Muscle repair after physiological damage relies on nuclear migration for cellular reconstruction. Science. 374 (6565), 355-359 (2021).
- Almonacid, M., Terret, M. E., Verlhac, M. H. Control of nucleus positioning in mouse oocytes. Semin Cell Develop Biol. 82, 34-40 (2018).
- Brunet, S., Maro, B. Germinal vesicle position and meiotic maturation in mouse oocyte. Reproduction. 133 (6), 1069-1072 (2007).
- Levi, M., Ghetler, Y., Shulman, A., Shalgi, R. Morphological and molecular markers are correlated with maturation-competence of human oocytes. Hum Reprod. 28 (9), 2482-2489 (2013).
- Almonacid, M., et al. Active diffusion positions the nucleus in mouse oocytes. Nat Cell Biol. 17 (4), 470-479 (2015).
- Almonacid, M., et al. Active fluctuations of the nuclear envelope shape the transcriptional dynamics in oocytes. Dev Cell. 51 (2), 145-157 (2019).
- Al Jord, A., et al. Cytoplasmic forces functionally reorganize nuclear condensates in oocytes. Nat Commun. 13 (1), 5070 (2022).
- Shin, Y., Brangwynne, C. P. Liquid phase condensation in cell physiology and disease. Science. 357 (6357), eaaf4382 (2017).
- Banani, S. F., Lee, H. O., Hyman, A. A., Rosen, M. K. Biomolecular condensates: organizers of cellular biochemistry. Nat Rev. Mol Cell Biol. 18 (5), 285-298 (2017).
- Lyon, A. S., Peeples, W. B., Rosen, M. K. A framework for understanding the functions of biomolecular condensates across scales. Nat Rev. Mol Cell Biol. 22 (3), 215-235 (2021).
- Gordon, J. M., Phizicky, D. V., Neugebauer, K. M. Nuclear mechanisms of gene expression control: pre-mRNA splicing as a life or death decision. Curr Opin Genet Dev. 67, 67-76 (2021).
- Barutcu, A. R. Systematic mapping of nuclear domain-associated transcripts reveals speckles and lamina as hubs of functionally distinct retained introns. Mol Cell. 82 (5), 1035-1052.e9 (2022).
- Guo, M. Probing the stochastic, motor-driven properties of the cytoplasm using force spectrum microscopy. Cell. 158 (4), 822-832 (2014).
- Verlhac, M. H., Kubiak, J. Z., Clarke, H. J., Maro, B. Microtubule and chromatin behavior follow MAP kinase activity but not MPF activity during meiosis in mouse oocytes. Development. 120 (4), 1017-1025 (1994).
- Reis, A., Chang, H. Y., Levasseur, M., Jones, K. T. APCcdh1 activity in mouse oocytes prevents entry into the first meiotic division. Nat Cell Biol. 8 (5), 539-540 (2006).
- El-Hayek, S., Clarke, H. J. Control of oocyte growth and development by intercellular communication within the follicular niche. Results Probl Cell Differ. 58, 191-224 (2016).
- Dumont, J. A centriole- and RanGTP-independent spindle assembly pathway in meiosis I of vertebrate oocytes. J Cell Biol. 176 (3), 295-305 (2007).
- Kaláb, P., Pralle, A., Isacoff, E. Y., Heald, R., Weis, K. Analysis of a RanGTP-regulated gradient in mitotic somatic cells. Nature. 440 (7084), 697-701 (2006).
- Lafontaine, D. L. J., Riback, J. A., Bascetin, R., Brangwynne, C. P. The nucleolus as a multiphase liquid condensate. Nat Rev. Mol Cell Biol. 22 (3), 165-182 (2021).
- Terret, M. E., et al. DOC1R: a MAP kinase substrate that control microtubule organization of metaphase II mouse oocytes. Development. 130 (21), 5169-5177 (2003).
- Dumont, J., Verlhac, M. H. Using FRET to study RanGTP gradients in live mouse oocytes. Methods Mol Biol. 957, 107-120 (2013).
- McSwiggen, D. T., Mir, M., Darzacq, X., Tjian, R. Evaluating phase separation in live cells: diagnosis, caveats, and functional consequences. Gene Develop. 33 (23-24), 1619-1634 (2019).
- OOCytes. , https://github.com/Carreau/OOCytes (2014).
- Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE transactions on image processing. 7 (1), 27-41 (1998).
- ImageJ. , https://imagej.github.io/update-sites/big-epfl (2023).
- Hebert, B., Costantino, S., Wiseman, P. W. Spatiotemporal image correlation spectroscopy (STICS) theory, verification, and application to protein velocity mapping in living CHO cells. Biophys J. 88 (5), 3601-3614 (2005).
- Yi, K., et al. Dynamic maintenance of asymmetric meiotic spindle position through Arp2/3-complex-driven cytoplasmic streaming in mouse oocytes. Nat Cell Biol. 13 (10), 1252-1258 (2011).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9, 676-682 (2012).
- Stowers ImageJ Plugins. , https://research.stowers.org/imagejplugins/ (2023).
- Luisier, F., Vonesch, C., Blu, T., Unser, M. Fast interscale wavelet denoising of Poisson-corrupted images. Signal Process. 90 (2), 415-427 (2010).
- Ovocyte_Nucleus. , https://github.com/orion-cirb/Ovocyte_Nucleus (2023).
- Letort, G. gletort/ImageJFiles: GLijplugs_v0.2.0. , doi: 10.5281/zenodo.6854802 (2022).
- ImageJFiles. , https://github.com/gletort/ImageJFiles/tree/master/radioak (2023).
- Chu, F. Y., Haley, S. C., Zidovska, A. On the origin of shape fluctuations of the cell nucleus. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (39), 10338-10343 (2017).
- Caragine, C. M., Haley, S. C., Zidovska, A. Surface fluctuations and coalescence of nucleolar droplets in the human cell nucleus. Phys Rev Lett. 121 (14), 148101 (2018).
- Introini, V., Kidiyoor, G. R., Porcella, G., Cicuta, P., Cosentino Lagomarsino, M. Centripetal nuclear shape fluctuations associate with chromatin condensation in early prophase. Commun Biol. 6 (1), 1-11 (2023).
- Boija, A., Klein, I. A., Young, R. A.
