In-vivo Calciumbilleddannelse af sensoriske neuroner i rotte trigeminusganglion

Summary

Genetisk kodede calciumindikatorer (GECI) muliggør en robust analyse på populationsniveau af sensorisk neuronsignalering. Her har vi udviklet en ny tilgang, der giver mulighed for in vivo GECI-visualisering af rottetrigeminusganglier neuronaktivitet.

Abstract

Genetisk kodede calciumindikatorer (GECI’er) muliggør billeddannelsesteknikker til overvågning af ændringer i intracellulært calcium i målrettede cellepopulationer. Deres store signal-støj-forhold gør GECI’er til et kraftfuldt værktøj til at detektere stimulusfremkaldt aktivitet i sensoriske neuroner. GECI’er letter analyse på populationsniveau af stimuluskodning med antallet af neuroner, der kan studeres samtidigt. Denne populationskodning udføres mest hensigtsmæssigt in vivo. Dorsalrodsganglier (DRG), som huser soma af sensoriske neuroner, der inderverer somatiske og viscerale strukturer under nakken, bruges mest til in vivo-billeddannelse , fordi disse strukturer er relativt let tilgængelige. For nylig blev denne teknik brugt i mus til at studere sensoriske neuroner i trigeminusganglion (TG), der inderverer orale og kraniofaciale strukturer. Der er mange grunde til at studere TG ud over DRG, herunder den lange liste over smertesyndromer, der er specifikke for orale og kraniofaciale strukturer, der synes at afspejle ændringer i sensorisk neuronaktivitet, såsom trigeminusneuralgi. Mus bruges mest i undersøgelsen af DRG- og TG-neuroner på grund af tilgængeligheden af genetiske værktøjer. Men med forskelle i størrelse, nem håndtering og potentielt vigtige artsforskelle er der grund til at studere rotter frem for muse-TG-neuroner. Således udviklede vi en tilgang til billeddannelse af rotte-TG-neuroner in vivo. Vi injicerede neonatale hvalpe (p2) intraperitonealt med en AAV-kodning GCaMP6’er, hvilket resulterede i >90% infektion af både TG- og DRG-neuroner. TG blev visualiseret hos den voksne efter kraniotomi og dekortikation, og ændringer i GCaMP6s fluorescens blev overvåget i TG-neuroner efter stimulering af mandibulære og maksillære områder i ansigtet. Vi bekræftede, at stigninger i fluorescens blev stimulusfremkaldt med perifer nerveblok. Selvom denne tilgang har mange potentielle anvendelser, bruger vi den til at karakterisere underpopulationen (e) af TG-neuroner, der er ændret efter perifer nerveskade.

Introduction

Somatosensation, den neurale kodning af mekaniske, termiske og kemiske stimuli, der påvirker huden eller andre kropslige strukturer, herunder muskler, knogler og indvolde, starter med aktivitet i primære afferente neuroner, der inderverer disse strukturer¹. Enkeltenhedsbaserede elektrofysiologiske tilgange har givet et væld af oplysninger om de afferente undertyper, der er involveret i denne proces, samt hvordan deres stimulus-responsegenskaber kan ændre sig over tid ^1,2,3. Mens der stadig er stærke beviser til støtte for den mærkede linjeteori, hvilket tyder på, at specifikke sensoriske modaliteter formidles af specifikke subpopulationer af neuroner, antyder mange underpopulationers evne til at reagere på de samme typer mekaniske, termiske og kemiske stimuli, at størstedelen af somatosensoriske stimuli er kodet af flere underpopulationer af neuroner^{4, 5}. Således vil en bedre forståelse af somatosensation kun komme med evnen til at studere aktiviteten af 10’erne, hvis ikke hundredvis, af neuroner samtidigt.

Fremskridt inden for optiske tilgange med den relativt nylige fremkomst af konfokale og efterfølgende multifoton- og digitale billeddannelsesteknikker har lettet evnen til at udføre relativt ikke-invasive analyser på populationsniveau af neuronal aktivitet ^6,7. En af de sidste forhindringer i anvendelsen af denne teknologi har været udviklingen af værktøjer til at muliggøre optisk vurdering af neural aktivitet. I betragtning af hastigheden af et handlingspotentiale, der kan starte og slutte på mindre end et millisekund, ville et spændingsfølsomt farvestof med kapacitet til at følge ændringer i membranpotentiale med hastigheden af et handlingspotentiale være det ideelle værktøj til dette formål. Men mens der har været enorme fremskridt på dette område 7,8,9,10, er signal-støj-forholdet for mange af disse farvestoffer stadig ikke helt højt nok til at muliggøre en befolkningsanalyse af hundredvis af neuroner på enkeltcelleniveau. Som en alternativ tilgang har efterforskere vendt sig til at overvåge ændringer i intracellulær Ca²⁺ koncentration ([Ca²⁺]_i). Begrænsningerne med denne strategi har været klare fra starten og inkluderer det faktum, at en stigning i [Ca²⁺]_i er et indirekte mål for neural aktivitet¹¹; at en stigning i [Ca²⁺]_i kan forekomme uafhængigt af Ca²⁺ tilstrømning i forbindelse med aktivering af spændingsstyrede Ca²⁺ kanaler (VGCC’er)^12,13; at størrelsen og varigheden af en^Ca2+-transient kan styres ved processer, der er uafhængige af VGCC-aktivitet 11,12,14; og at tidsforløbet for Ca²⁺ transienter langt overstiger tidsforløbet for et aktionspotentiale¹⁵. Ikke desto mindre er der en række væsentlige fordele forbundet med brugen af Ca²⁺ som et indirekte mål for neural aktivitet. Ikke mindst signal-støj-forholdet forbundet med de fleste Ca²⁺ indikatorer, hvilket afspejler både størrelsen af ændringen i intracellulær Ca²⁺ og det faktum, at signalet stammer fra cytosolens tredimensionelle rum snarere end cellemembranens todimensionelle rum. Med udviklingen af genetisk kodede Ca²⁺-indikatorer (GECI’er) er det desuden muligt at drage fordel af genetiske strategier til at drive ekspressionen af Ca²⁺-indikatorerne i specifikke subpopulationer af celler, hvilket letter analyser på populationsniveau i intakte præparater (f.eks. se¹⁶).

I betragtning af antallet af genetiske værktøjer, der nu er tilgængelige i mus, bør det ikke være nogen overraskelse, at GECI’er er blevet brugt mest i denne art. Muselinjer med konstitutiv GECI-ekspression i subpopulationer af sensoriske neuroner er blevet udviklet ^7,16,17. Med udviklingen af muselinjer, der udtrykker rekombinaser i specifikke celletyper, er det muligt at bruge endnu mere sofistikerede strategier til at kontrollere GECI-ekspression¹⁵. Men selvom disse værktøjer er stadig mere kraftfulde, er der en række grunde til, at andre arter, såsom rotter, kan være mere passende til nogle eksperimentelle spørgsmål. Disse omfatter den større størrelse, hvilket letter en række eksperimentelle manipulationer, der er vanskelige, hvis ikke umulige, i den mindre mus; den lette træning af rotter i relativt komplekse adfærdsmæssige opgaver; og i det mindste nogle tegn på, at biofysiske egenskaber og ekspressionsmønstre for flere ionkanaler i rottesensoriske neuroner kan være mere lig den, der observeres i humane sensoriske neuroner, end de samme kanaler i mus i forhold til den menneskelige¹⁸.

Mens transduktionen af somatosensoriske stimuli generelt forekommer i de perifere terminaler af primære afferenter, skal handlingspotentialet initieret i periferien passere gennem strukturen, der huser primær afferent somata, kaldet dorsal rod (DRG) eller trigeminale (TG) ganglier, inden de når centralnervesystemet¹⁹. Mens der er tegn på, at ikke alle handlingspotentialer, der formerer sig langs en primær afferent axon, vil invadere cellelegemet²⁰, en konsekvens af det faktum, at den primære afferente somata er forbundet med den vigtigste afferente axon via et T-kryds¹⁹, synes størstedelen af handlingspotentialer initieret i periferien at invadere soma²¹. Dette giver tre eksperimentelle fordele ved anvendelse af GECI’er til at vurdere populationskodning i primære afferenter: den store størrelse af cellelegemet i forhold til axonerne øger signalet til støj yderligere, når [Ca²⁺]_i anvendes som et indirekte mål for afferent aktivitet; DRG er generelt let tilgængelige; Og vurdering af aktivitet på et sted, der er rumligt fjernt fra de afferente terminaler, minimerer den potentielle virkning af operationen, der er nødvendig for at udsætte ganglierne på stimulus-responsegenskaberne hos de afferente terminaler. Men fordi TG er placeret under hjernen (eller over paletten), er de langt vanskeligere at få adgang til end DRG. Selvom der er mange ligheder mellem DRG- og TG-neuroner, er der også en voksende liste over forskelle. Dette inkluderer den omtrent somatotopiske organisering af neuroner i TG²², unikke strukturer innerveret, forskellige centrale terminale termineringsmønstre 23,24,25,26 og nu en voksende liste over forskelle i både genekspression^27,28 og funktionel receptorekspression²⁹. Derudover, fordi vi er interesserede i identifikation af perifere smertemekanismer, antyder det relativt store antal smertesyndromer, der synes at være unikke for trigeminussystemet (fx migræne, trigeminusneuralgi, brændende mundsyndrom), der synes at involvere afvigende aktivitet i primære afferenter 30,31,32, at TG skal undersøges direkte.

Mens stimulus-respons-egenskaber af TG-neuroner er blevet undersøgt med GECI’er i mus¹⁶, fordi årsagerne ovenfor tyder på, at rotten kan være en mere passende art til at løse en række eksperimentelle spørgsmål, var formålet med denne undersøgelse at udvikle en tilgang til at bruge GECI’er til at studere TG-neuroner hos rotten. For at opnå dette brugte vi en viral tilgang til at drive ekspressionen af GECI GCaMP6’erne i det perifere nervesystem. Vi fjernede derefter forhjernen for at give adgang til TG. Endelig blev mekaniske og termiske stimuli påført ansigtet, mens neuronale reaktioner blev vurderet under fluorescerende mikroskopi. Sammen understøtter disse data en rolle for at bruge rotten til at undersøge ændringer i TG under mange stater og udvide værktøjssættet til efterforskere, der er interesseret i sensorisk kodning i trigeminussystemet.

Protocol

Alle eksperimenter, der involverer brug af dyr i forskning, blev udført i overensstemmelse med standarder fremsat af National Institutes of Health og International Association for Study of Pain og blev godkendt af University of Pittsburgh Institutional Animal Care and Use Committee (protokol # 22051100). Ved afslutningen af hvert forsøg blev rotter aflivet via eksanguinering med hjerteperfusion af iskold fosfatbufret saltvand (PBS), en tilgang godkendt af American Veterinary Medical Association og University of Pittsbu…

Representative Results

Fordi vi tidligere har haft succes med AAV9-serotypen til infektion af rottesensoriske neuroner15, brugte vi denne serotype til ekspression af GCaMP6’er i rotte-TG-neuroner. Vi søgte derfor først at vurdere effektiviteten af sensorisk neuroninfektion af AAV9-CAG-GCaMP6s-WPRE-SV40 (AAV9-GCaMP), da denne virus blev administreret til neonatale rotteunger20. Denne virus bruger CAG-promotoren, som driver og opretholder høje niveauer af genekspression. Desuden har AAV9 vist si…

Discussion

Her demonstrerer vi en hurtig, ikke-invasiv måde at generere en GECI-rotte til billeddannelse af TG. Vi valgte en CAG-promotor til at drive og opretholde høje niveauer af genekspression. Mens tidligere undersøgelser tyder på, at andre AAV-serotyper effektivt kan drive genekspression i DRG-neuroner³⁹, er vores resultater i overensstemmelse med en nylig undersøgelse, der involverer intraperitoneal injektion af AAV hos nyfødte³², hvilket indikerer, at AAV9-serotypen er y…

Materials

AAV9-CAG-WPRE-GCaMP6s-SV40	Addgene	100844-AAV9	AAV9-GCaMP6s virus
ACEpromazine maleate	Covetrus	11695-0095-5	10 mg/mL
AnaSed (Xylazine) injection	AKORN Animal Health	23076-35-9	20 mg/mL
CTR5500 Electronics box	Leica	11 888 820	Power Supply
Cutwell burr drill bit	Ransom & Randolph		¼ round
DM 6000 FS	Leica	11 888 928	Base Stand
EL6000	Leica	EL6000	Light source with 120 W mercury bulb
Forceps	FST	11252-00	Dumont No. 05
Friedman rongeurs	FST	16000-14	2.5 mm cup size
Friedman-Pearson rongeurs	FST	16021-14	1 mm cup size
Heating pad (Temperature therapy pad)	STRYKER	8002-062-022
Ketamine hydrochloride	Covetrus	1695-0703-1	100 mg/mL
Plan Fluor 20x/0.40	Leica	MRH00105	20x objective, 0.4 NA10.8 mm WD
Power handle high-temp cautery pen	Bovie	HIT1	handheld Change-A-Tip cautery pen
Prime 95B	Photometrics	Prime 95B	CMOS Camera
Saline	Fisher Scientific	NC0291799	0.9% Sterile Saline
Scalpel blade	Fisher Scientific	22-079-701	size 15 disposable blade
Spatula	BRI	48-1460	brain spatula
Spring scissors	FST	91500-09	Student Vannas, 5 mm cutting edge
Spring scissors	FST	15012-12	Noyes, 14 mm cutting edge
STP6000 Smart touch panel	Leica	11 501 255	Control Panel
Syringe	Hamilton	80201	25 μL Model 1702 Luer Tip syringe
Water heater	Adroit	HTP-1500