In-vivo Calciumbeeldvorming van sensorische neuronen in het trigeminusganglion van de rat

Summary

Genetisch gecodeerde calciumindicatoren (GECI) maken een robuuste analyse op populatieniveau van sensorische neuronsignalering mogelijk. Hier hebben we een nieuwe benadering ontwikkeld die in vivo GECI-visualisatie van de activiteit van trigeminusganglia-neuronen bij ratten mogelijk maakt.

Abstract

Genetisch gecodeerde calciumindicatoren (GECI’s) maken beeldvormingstechnieken mogelijk om veranderingen in intracellulair calcium in gerichte celpopulaties te volgen. Hun grote signaal-ruisverhouding maakt GECI’s een krachtig hulpmiddel voor het detecteren van stimulus-opgewekte activiteit in sensorische neuronen. GECI’s vergemakkelijken analyse op populatieniveau van stimuluscodering met het aantal neuronen dat tegelijkertijd kan worden bestudeerd. Deze populatiecodering wordt het meest geschikt in vivo gedaan. Dorsale wortelganglia (DRG), die de soma van sensorische neuronen huisvesten die somatische en viscerale structuren onder de nek innerveren, worden het meest gebruikt voor in vivo beeldvorming omdat deze structuren relatief gemakkelijk toegankelijk zijn. Meer recentelijk werd deze techniek bij muizen gebruikt om sensorische neuronen in het trigeminusganglion (TG) te bestuderen die orale en craniofaciale structuren innerveren. Er zijn veel redenen om TG naast DRG te bestuderen, waaronder de lange lijst van pijnsyndromen die specifiek zijn voor orale en craniofaciale structuren en die veranderingen in sensorische neuronactiviteit lijken te weerspiegelen, zoals trigeminusneuralgie. Muizen worden het meest gebruikt in de studie van DRG- en TG-neuronen vanwege de beschikbaarheid van genetische hulpmiddelen. Echter, met verschillen in grootte, gebruiksgemak en potentieel belangrijke soortverschillen, zijn er redenen om TG-neuronen bij ratten te bestuderen in plaats van bij muizen. Zo ontwikkelden we een aanpak voor het in vivo in beeld brengen van TG-neuronen van ratten. We injecteerden neonatale pups (p2) intraperitoneaal met een AAV die codeert voor GCaMP6s, wat resulteerde in >90% infectie van zowel TG- als DRG-neuronen. TG werd gevisualiseerd bij de volwassene na craniotomie en decorticatie, en veranderingen in GCaMP6s-fluorescentie werden gecontroleerd in TG-neuronen na stimulatie van mandibulaire en maxillaire gebieden van het gezicht. We bevestigden dat verhogingen van fluorescentie door stimulus werden opgeroepen met perifere zenuwblokkade. Hoewel deze benadering veel potentiële toepassingen heeft, gebruiken we het om de subpopulatie(s) van TG-neuronen te karakteriseren die zijn veranderd na perifere zenuwbeschadiging.

Introduction

Somatosensatie, de neurale codering van mechanische, thermische en chemische stimuli die inwerken op de huid of andere lichaamsstructuren, waaronder spieren, botten en ingewanden, begint met activiteit in primaire afferente neuronen die deze structuren innerveren1. Elektrofysiologische benaderingen op basis van één eenheid hebben een schat aan informatie opgeleverd over de afferente subtypes die bij dit proces betrokken zijn, evenals hoe hun stimulus-responseigenschappen in de loop van de tijd kunnen veranderen ^1,2,3. Hoewel er sterk bewijs blijft ter ondersteuning van de gelabelde lijntheorie, die suggereert dat specifieke sensorische modaliteiten worden overgebracht door specifieke subpopulatie(s) van neuronen, suggereert het vermogen van veel subpopulaties van neuronen om te reageren op dezelfde soorten mechanische, thermische en chemische stimuli dat de meerderheid van de somatosensorische stimuli wordt gecodeerd door meerdere subpopulaties van neuronen^{4, 5}. okt. Een beter begrip van somatosensatie zal dus alleen komen met de mogelijkheid om de activiteit van 10’s, zo niet honderden neuronen tegelijkertijd te bestuderen.

Vooruitgang in optische benaderingen met de relatief recente komst van confocale en vervolgens multifoton- en digitale beeldvormingstechnieken hebben de mogelijkheid vergemakkelijkt om relatief niet-invasieve analyses op populatieniveau van neuronale activiteit uit te voeren ^6,7. Een van de laatste hindernissen bij de toepassing van deze technologie is de ontwikkeling van hulpmiddelen om de optische beoordeling van neurale activiteit mogelijk te maken. Gezien de snelheid van een actiepotentiaal die in minder dan een milliseconde kan beginnen en eindigen, zou een spanningsgevoelige kleurstof met het vermogen om veranderingen in membraanpotentiaal te volgen met de snelheid van een actiepotentiaal het ideale hulpmiddel voor dit doel zijn. Maar hoewel er enorme vooruitgang is geboekt op dit gebied 7,8,9,10, is de signaal-ruisverhouding voor veel van deze kleurstoffen nog steeds niet hoog genoeg om een populatieanalyse van honderden neuronen op celniveau mogelijk te maken. Als alternatieve benadering hebben onderzoekers zich gericht op het monitoren van veranderingen in de intracellulaire Ca^2+-concentratie ([Ca²⁺]_i). De beperkingen van deze strategie zijn vanaf het begin duidelijk geweest en omvatten het feit dat een toename van [Ca²⁺]_i een indirecte maat is voor neurale activiteit¹¹; dat een toename van [Ca²⁺]_i kan optreden onafhankelijk van de instroom van Ca²⁺ die gepaard gaat met de activering van spanningsafhankelijke Ca²⁺-kanalen (VGCC’s)^12,13; dat de omvang en de duur van een Ca²⁺ transiënt kunnen worden gecontroleerd door processen die onafhankelijk zijn van VGCC-activiteit 11,12,14; en dat het tijdsverloop van Ca²⁺ transiënten veel groter is dan dat van een actiepotentiaal¹⁵. Desalniettemin zijn er een aantal belangrijke voordelen verbonden aan het gebruik van Ca²⁺ als indirecte maat voor neurale activiteit. Niet de minste hiervan is de signaal-ruisverhouding die wordt geassocieerd met de meeste Ca²⁺-indicatoren, die zowel de omvang van de verandering in intracellulaire Ca²⁺ weerspiegelt als het feit dat het signaal voortkomt uit de driedimensionale ruimte van het cytosol in plaats van de tweedimensionale ruimte van het celmembraan. Bovendien is het met de ontwikkeling van genetisch gecodeerde Ca²⁺-indicatoren (GECI’s) mogelijk om te profiteren van genetische strategieën om de expressie van de Ca²⁺-indicatoren in specifieke subpopulaties van cellen te stimuleren, waardoor analyses op populatieniveau in intacte preparaten worden vergemakkelijkt (bijv.^{zie 16}).

Gezien het aantal genetische hulpmiddelen dat nu beschikbaar is in muizen, zou het geen verrassing moeten zijn dat GECI’s het meest op grote schaal zijn gebruikt bij deze soort. Muislijnen met constitutieve GECI-expressie in subpopulaties van sensorische neuronen zijn ontwikkeld ^7,16,17. Met de ontwikkeling van muislijnen die recombinasen tot expressie brengen in specifieke celtypen, is het mogelijk om nog geavanceerdere strategieën te gebruiken om GECI-expressie te beheersen¹⁵. Hoewel deze instrumenten steeds krachtiger worden, zijn er een aantal redenen waarom andere soorten, zoals ratten, geschikter zouden kunnen zijn voor sommige experimentele vragen. Deze omvatten het grotere formaat, waardoor een aantal experimentele manipulaties mogelijk zijn die moeilijk, zo niet onmogelijk zijn bij de kleinere muis; het gemak waarmee ratten kunnen worden getraind in relatief complexe gedragstaken; en op zijn minst enig bewijs dat biofysische eigenschappen en expressiepatronen van verschillende ionkanalen in sensorische neuronen van ratten meer lijken op die waargenomen in menselijke sensorische neuronen dan dezelfde kanalen in muizen ten opzichte van de mens^.

Hoewel de transductie van somatosensorische stimuli over het algemeen plaatsvindt in de perifere uiteinden van primaire afferenten, moet het actiepotentiaal dat in de periferie wordt geïnitieerd, door de structuur gaan die primaire afferente somata herbergt, ook wel dorsale wortel (DRG) of trigeminus (TG) ganglia genoemd voordat het het centrale zenuwstelsel bereikt¹⁹. Hoewel er aanwijzingen zijn dat niet elke actiepotentiaal die zich voortplant langs een primair afferent axon het cellichaam^{zal binnendringen 20}, een gevolg van het feit dat de primaire afferente somata verbonden zijn met het belangrijkste afferente axon via een T-splitsing¹⁹, lijken de meeste actiepotentialen die in de periferie worden geïnitieerd de soma²¹ binnen te dringen. Dit levert drie experimentele voordelen op bij het gebruik van GECI’s om populatiecodering in primaire afferenten te beoordelen: de grote omvang van het cellichaam ten opzichte van de axonen verhoogt het signaal tot ruis verder bij gebruik van [Ca²⁺]_i als een indirecte maat voor afferente activiteit; de DRG zijn over het algemeen gemakkelijk toegankelijk; En het beoordelen van activiteit op een plaats die ruimtelijk ver verwijderd is van de afferente terminals, minimaliseert de potentiële impact van de operatie die nodig is om de ganglia bloot te leggen op de stimulus-responseigenschappen van de afferente terminals. Omdat TG zich echter onder de hersenen (of boven het palet) bevindt, zijn ze veel moeilijker toegankelijk dan DRG. Bovendien, hoewel er veel overeenkomsten zijn tussen DRG- en TG-neuronen, is er ook een groeiende lijst met verschillen. Dit omvat de ruwweg somatotopische organisatie van neuronen in de TG²², unieke geïnnerveerde structuren, verschillende centrale terminale beëindigingspatronen 23,24,25,26, en nu een groeiende lijst van verschillen in zowel genexpressie^27,28 als functionele receptorexpressie²⁹. Bovendien, omdat we geïnteresseerd zijn in de identificatie van perifere mechanismen van pijn, suggereert het relatief grote aantal pijnsyndromen die uniek lijken te zijn voor het trigeminussysteem (bijv. migraine, trigeminusneuralgie, brandende mondsyndroom) die afwijkende activiteit in primaire afferenten lijken te omvatten 30,31,32, dat de TG rechtstreeks moet worden bestudeerd.

Dus, terwijl stimulus-respons eigenschappen van TG-neuronen zijn bestudeerd met GECI’s in de muis¹⁶, omdat de hierboven genoemde redenen suggereren dat de rat een geschiktere soort kan zijn om een verscheidenheid aan experimentele vragen te beantwoorden, was het doel van de huidige studie om een benadering te ontwikkelen om GECI’s te gebruiken om TG-neuronen in de rat te bestuderen. Om dit te bereiken, gebruikten we een virale benadering om de expressie van de GECI GCaMP6’s in het perifere zenuwstelsel te stimuleren. Vervolgens hebben we de voorhersenen verwijderd om toegang te krijgen tot de TG. Ten slotte werden mechanische en thermische stimuli op het gezicht aangebracht, terwijl neuronale reacties werden beoordeeld onder fluorescerende microscopie. Samen ondersteunen deze gegevens een rol voor het gebruik van de rat om veranderingen in de TG onder veel staten te onderzoeken, waardoor de toolkit wordt uitgebreid voor onderzoekers die geïnteresseerd zijn in sensorische codering in het trigeminussysteem.

Protocol

Alle experimenten met het gebruik van dieren in onderzoek werden uitgevoerd in overeenstemming met de normen die zijn opgesteld door de National Institutes of Health en de International Association for the Study of Pain en zijn goedgekeurd door de University of Pittsburgh Institutional Animal Care and Use Committee (protocol #22051100). Aan het einde van elk experiment werden ratten geëuthanaseerd via exanguinatie met hartperfusie van ijskoude fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), een benadering die is goedgekeurd door…

Representative Results

Omdat we eerder succes hebben gehad met het AAV9-serotype voor de infectie van sensorische neuronen van ratten15, gebruikten we dit serotype voor de expressie van GCaMP6’s in TG-neuronen van ratten. Daarom hebben we eerst geprobeerd de sensorische neuroninfectie-efficiëntie van AAV9-CAG-GCaMP6s-WPRE-SV40 (AAV9-GCaMP) te beoordelen toen dit virus werd toegediend aan neonatale rattenpups20. Dit virus maakt gebruik van de CAG-promotor, die een hoge mate van genexpressie stimu…

Discussion

Hier demonstreren we een snelle, niet-invasieve manier om een GECI-rat te genereren voor beeldvorming van de TG. We kozen voor een CAG-promotor om hoge niveaus van genexpressie te stimuleren en te behouden. Hoewel eerdere studies suggereren dat andere AAV-serotypen de genexpressie in DRG-neuronen efficiënt kunnen stimuleren³⁹, zijn onze resultaten consistent met een recente studie met intraperitoneale injectie van AAV bij pasgeborenen³², wat aangeeft dat het AAV9-serotype …

Materials

AAV9-CAG-WPRE-GCaMP6s-SV40	Addgene	100844-AAV9	AAV9-GCaMP6s virus
ACEpromazine maleate	Covetrus	11695-0095-5	10 mg/mL
AnaSed (Xylazine) injection	AKORN Animal Health	23076-35-9	20 mg/mL
CTR5500 Electronics box	Leica	11 888 820	Power Supply
Cutwell burr drill bit	Ransom & Randolph		¼ round
DM 6000 FS	Leica	11 888 928	Base Stand
EL6000	Leica	EL6000	Light source with 120 W mercury bulb
Forceps	FST	11252-00	Dumont No. 05
Friedman rongeurs	FST	16000-14	2.5 mm cup size
Friedman-Pearson rongeurs	FST	16021-14	1 mm cup size
Heating pad (Temperature therapy pad)	STRYKER	8002-062-022
Ketamine hydrochloride	Covetrus	1695-0703-1	100 mg/mL
Plan Fluor 20x/0.40	Leica	MRH00105	20x objective, 0.4 NA10.8 mm WD
Power handle high-temp cautery pen	Bovie	HIT1	handheld Change-A-Tip cautery pen
Prime 95B	Photometrics	Prime 95B	CMOS Camera
Saline	Fisher Scientific	NC0291799	0.9% Sterile Saline
Scalpel blade	Fisher Scientific	22-079-701	size 15 disposable blade
Spatula	BRI	48-1460	brain spatula
Spring scissors	FST	91500-09	Student Vannas, 5 mm cutting edge
Spring scissors	FST	15012-12	Noyes, 14 mm cutting edge
STP6000 Smart touch panel	Leica	11 501 255	Control Panel
Syringe	Hamilton	80201	25 μL Model 1702 Luer Tip syringe
Water heater	Adroit	HTP-1500