생체 내 쥐 삼차신경절(Rat Trigeminal Ganglion)의 감각 뉴런의 칼슘 이미징
Summary
유전적으로 인코딩된 칼슘 지표(GECI)는 감각 뉴런 신호에 대한 강력한 집단 수준 분석을 가능하게 합니다. 여기에서 우리는 쥐의 삼차신경절 뉴런 활동의 생체 내 GECI 시각화를 가능하게 하는 새로운 접근 방식을 개발했습니다.
Abstract
유전자 인코딩 칼슘 지표(GECI)를 사용하면 이미징 기술을 통해 표적 세포 집단에서 세포 내 칼슘의 변화를 모니터링할 수 있습니다. 신호 대 잡음비가 크기 때문에 GECI는 감각 뉴런에서 자극 유발 활동을 감지하는 강력한 도구입니다. GECI는 동시에 연구할 수 있는 뉴런의 수로 자극 인코딩의 집단 수준 분석을 용이하게 합니다. 이 모집단 인코딩은 생체 내에서 가장 적절하게 수행됩니다. 목 아래의 체세포 및 내장 구조를 신경 자극하는 감각 뉴런의 소마를 수용하는 등근 신경절(DRG)은 이러한 구조에 비교적 쉽게 접근할 수 있기 때문에 생체 내 이미징에 가장 광범위하게 사용됩니다. 최근에는 생쥐를 대상으로 구강 및 두개안면 구조를 자극하는 삼차신경절(TG)의 감각 뉴런을 연구하는 데 사용되었습니다. 삼차신경통과 같은 감각 뉴런 활동의 변화를 반영하는 것으로 보이는 구강 및 두개안면 구조에 특이적인 통증 증후군의 긴 목록을 포함하여 DRG 외에도 TG를 연구해야 하는 많은 이유가 있습니다. 생쥐는 유전 도구의 가용성 때문에 DRG 및 TG 뉴런 연구에서 가장 광범위하게 사용됩니다. 그러나 크기의 차이, 취급의 용이성, 잠재적으로 중요한 종의 차이로 인해 쥐 TG 뉴런이 아닌 쥐를 연구해야 하는 이유가 있습니다. 따라서 우리는 생체 내에서 쥐 TG 뉴런을 이미징하는 접근 방식을 개발했습니다. 신생아 새끼(p2)에 GCaMP6를 인코딩하는 AAV를 복강내로 주입한 결과, TG 및 DRG 뉴런이 >90% 감염되었습니다. TG는 개두술 및 탈피술 후 성인에서 시각화되었으며, 얼굴의 하악 및 상악 부위를 자극한 후 TG 뉴런에서 GCaMP6s 형광의 변화를 모니터링했습니다. 형광의 증가는 말초 신경 차단에 의한 자극에 의한 것임을 확인했습니다. 이 접근법은 많은 잠재적 용도를 가지고 있지만, 우리는 말초 신경 손상 후 변화된 TG 뉴런의 하위 집단을 특성화하는 데 사용하고 있습니다.
Introduction
피부나 근육, 뼈, 내장을 포함한 다른 신체 구조에 영향을 미치는 기계적, 열적, 화학적 자극의 신경 인코딩인 체성 감각은 이러한 구조를 신경 자극하는 일차 구심성 뉴런의 활동으로 시작됩니다1. 단일 단위 기반 전기 생리학적 접근법은 이 과정에 관련된 구심성 아형에 대한 풍부한 정보와 자극-반응 특성이 시간이 지남에 따라 어떻게 변할 수 있는지에 대한 풍부한 정보를 제공했습니다 1,2,3. 그러나, 특정 감각 양식이 뉴런의 특정 하위 집단(들)에 의해 전달된다는 것을 시사하는 표지된 선 이론을 지지하는 강력한 증거가 남아 있지만, 동일한 유형의 기계적, 열적, 화학적 자극에 반응하는 많은 뉴런 하위 집단의 능력은 체성 감각 자극의 대부분이 뉴런의 여러 하위 집단에 의해 암호화된다는 것을 시사한다4, 5. 따라서 체성 감각에 대한 더 나은 이해는 수백 개는 아니더라도 10개의 뉴런의 활동을 동시에 연구할 수 있는 능력과 함께 이루어질 것입니다.
비교적 최근의 공초점 및 다광자 및 디지털 이미징 기술의 출현과 함께 광학 접근법의 발전은 신경 활동에 대한 상대적으로 비침습적인 인구 수준 분석을 수행할 수 있는 능력을 촉진했습니다 6,7. 이 기술 적용의 마지막 장애물 중 하나는 신경 활동의 광학적 평가를 가능하게 하는 도구의 개발이었습니다. 밀리초 이내에 시작하고 끝날 수 있는 활동 전위의 속도를 감안할 때, 활동 전위의 속도로 막 전위의 변화를 추적할 수 있는 전압에 민감한 염료가 이러한 목적에 이상적인 도구가 될 것입니다. 그러나 이 영역7,8,9,10에서 엄청난 진전이 있었지만 이러한 염료 중 많은 부분에 대한 신호 대 잡음비는 여전히 단일 세포 수준에서 수백 개의 뉴런 집단 분석을 가능하게 할 만큼 충분히 높지 않습니다. 대안으로 연구자들은 세포 내 Ca2+ 농도([Ca2+]i)의 변화를 모니터링하는 것으로 전환했습니다. 이 전략의 한계는 처음부터 분명했으며, [Ca2+]i의 증가가 신경 활동의 간접적인 척도라는 사실을 포함한다11; [Ca2+]i의 증가는 전압 개폐 Ca2+ 채널(VGCC)의 활성화와 관련된 Ca2+ 유입과 독립적으로 발생할 수 있습니다.12,13; Ca2+ 과도 현상의 크기 및 지속 시간은 VGCC 활성(11,12,14)과 무관한 프로세스에 의해 제어될 수 있습니다. 그리고 Ca2+ 과도 현상의 시간 경과는 활동 전위15의 시간 경과를 훨씬 초과합니다. 그럼에도 불구하고 신경 활동의 간접 측정으로 Ca2+를 사용하는 것과 관련된 여러 가지 중요한 이점이 있습니다. 이들 중 가장 중요한 것은 대부분의 Ca2+ 지표와 관련된 신호 대 잡음비로, 세포 내 Ca2+의 변화 크기와 신호가 세포막의 2차원 공간이 아닌 세포질의 3차원 공간에서 발생한다는 사실을 모두 반영합니다. 또한, 유전적으로 인코딩된 Ca2+ 지표(GECI)의 개발로 세포의 특정 하위 집단에서 Ca2+ 지표의 발현을 유도하는 유전 전략을 활용할 수 있으며, 온전한 제제에서 집단 수준 분석을 용이하게 할 수 있습니다(예:16 참조).
현재 생쥐에서 사용할 수 있는 유전 도구의 수를 감안할 때 GECI가 이 종에서 가장 광범위하게 사용되었다는 것은 놀라운 일이 아닙니다. 감각 뉴런의 하위 집단에서 구성적 GECI 발현을 갖는 마우스 라인이 개발되었습니다 7,16,17. 특정 세포 유형에서 재조합 효소를 발현하는 마우스 라인의 개발로 GECI 발현을 제어하기 위해 훨씬 더 정교한 전략을 사용할 수 있습니다15. 그러나 이러한 도구가 그 어느 때보다 강력하지만 쥐와 같은 다른 종이 일부 실험 질문에 더 적합할 수 있는 여러 가지 이유가 있습니다. 여기에는 더 큰 크기가 포함되어있어 더 작은 마우스에서 불가능하지는 않더라도 어려운 여러 가지 실험적 조작을 용이하게합니다. 비교적 복잡한 행동 작업에서 쥐를 훈련시키는 용이성; 그리고 쥐의 감각 뉴런에서 여러 이온 채널의 생물물리학적 특성과 발현 패턴이 인간에 비해 마우스에서 동일한 채널보다 인간 감각 뉴런에서 관찰되는 것과 더 유사할 수 있다는 적어도 일부 증거가있다 18.
체성 감각 자극의 전달은 일반적으로 일차 구심성의 말초 말단에서 발생하지만, 말초에서 시작된 활동 전위는 중추 신경계에 도달하기 전에 등쪽 뿌리(DRG) 또는 삼차신경절(TG)이라고 하는 일차 구심성 소마타를 수용하는 구조를 통과해야 한다19. 일차 구심성 축삭돌기를 따라 전파되는 모든 활동 전위가 세포체(20)를 침범하는 것은 아니라는 증거가 있는 반면, 일차 구심성 소마타가 T-접합(19)을 통해 주 구심성 축삭돌기에 연결된다는 사실의 결과로서, 주변부에서 개시된 대부분의 활동 전위는 소마(21)를 침범하는 것으로 나타난다. 이것은 GECI를 사용하여 일차 구심성에서 집단 코딩을 평가할 때 세 가지 실험적 이점을 제공합니다 : 축삭에 비해 세포체의 크기가 크면 [Ca2 +] i를 구심성 활성의 간접 측정으로 사용할 때 신호 대 잡음이 더욱 증가합니다. DRG는 일반적으로 쉽게 액세스할 수 있습니다. 그리고 구심성 말단에서 공간적으로 멀리 떨어진 부위에서의 활동을 평가하면 신경절을 노출시키는 데 필요한 수술이 구심성 말단의 자극-반응 특성에 미치는 잠재적 영향을 최소화할 수 있습니다. 그러나 TG는 뇌 아래(또는 팔레트 위)에 위치하기 때문에 DRG보다 접근하기가 훨씬 더 어렵습니다. 또한 DRG와 TG 뉴런 사이에는 많은 유사점이 있지만 차이점도 점점 더 많아지고 있습니다. 여기에는 TG22의 뉴런의 대략적인 체성 조직, 신경 분포된 독특한 구조, 상이한 중심 말단 종결 패턴(23,24,25,26), 그리고 이제 유전자 발현(27,28)과 기능적 수용체 발현(29)의 차이점이 증가하고 있다. 또한, 통증의 말초 기전을 규명하는 데 관심이 있기 때문에, 삼차계에 고유한 것으로 보이는 통증 증후군(예: 편두통, 삼차신경통, 구강 작열감 증후군)이 1차 구심성30,31,32에서 비정상적인 활동을 수반하는 것으로 보이는 비교적 많은 수의 통증 증후군은 중성지방을 직접 연구할 필요가 있음을 시사한다.
따라서, 쥐16에서 TG 뉴런의 자극-반응 특성이 GECI로 연구되었지만, 위에 열거된 이유들은 쥐가 다양한 실험적 질문들을 다루기에 더 적합한 종일 수 있음을 시사하기 때문에, 본 연구의 목적은 쥐에서 TG 뉴런을 연구하기 위해 GECI를 사용하는 접근법을 개발하는 것이었다. 이를 달성하기 위해 바이러스 접근법을 활용하여 말초 신경계에서 GECI GCaMP6의 발현을 유도했습니다. 그런 다음 TG에 접근할 수 있도록 전뇌를 제거했습니다. 마지막으로, 기계적 및 열적 자극을 얼굴에 가하는 동안 형광 현미경으로 신경 반응을 평가했습니다. 이러한 데이터는 여러 상태에서 TG의 변화를 조사하기 위해 쥐를 활용하는 역할을 지원하며, 삼차계의 감각 코딩에 관심이 있는 연구자를 위한 툴킷을 확장합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에서는 TG를 이미징하기 위해 GECI 쥐를 생성하는 빠르고 비침습적인 방법을 보여줍니다. 우리는 높은 수준의 유전자 발현을 유도하고 유지하기 위해 CAG 프로모터를 선택했습니다. 이전 연구들은 다른 AAV 혈청형이 DRG 뉴런에서 유전자 발현을 효율적으로 유도할 수 있음을 시사하지만39, 우리의 결과는 AAV9 혈청형이 쥐의 신생아 감각 뉴런의 감염에 매우 효율적임을 나타내는 ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
라이카 현미경 및 변태 프로그램을 사용해 주신 Kathy Albers 박사님과 Brian Davis 박사님, 열 펠티에 장치 제작에 도움을 주신 Charles Warwick 박사님, 수술 준비 문제 해결에 도움을 주신 Raymond Sekula 박사님께 감사드립니다. 이 연구는 미국 국립보건원(National Institutes of Health: F31NS125993, JYG), T32NS073548(JYG), R01NS122784(MSG 및 RS)의 보조금으로 지원되었습니다.
Materials
| AAV9-CAG-WPRE-GCaMP6s-SV40 | Addgene | 100844-AAV9 | AAV9-GCaMP6s virus |
| ACEpromazine maleate | Covetrus | 11695-0095-5 | 10 mg/mL |
| AnaSed (Xylazine) injection | AKORN Animal Health | 23076-35-9 | 20 mg/mL |
| CTR5500 Electronics box | Leica | 11 888 820 | Power Supply |
| Cutwell burr drill bit | Ransom & Randolph | ¼ round | |
| DM 6000 FS | Leica | 11 888 928 | Base Stand |
| EL6000 | Leica | EL6000 | Light source with 120 W mercury bulb |
| Forceps | FST | 11252-00 | Dumont No. 05 |
| Friedman rongeurs | FST | 16000-14 | 2.5 mm cup size |
| Friedman-Pearson rongeurs | FST | 16021-14 | 1 mm cup size |
| Heating pad (Temperature therapy pad) | STRYKER | 8002-062-022 | |
| Ketamine hydrochloride | Covetrus | 1695-0703-1 | 100 mg/mL |
| Plan Fluor 20x/0.40 | Leica | MRH00105 | 20x objective, 0.4 NA10.8 mm WD |
| Power handle high-temp cautery pen | Bovie | HIT1 | handheld Change-A-Tip cautery pen |
| Prime 95B | Photometrics | Prime 95B | CMOS Camera |
| Saline | Fisher Scientific | NC0291799 | 0.9% Sterile Saline |
| Scalpel blade | Fisher Scientific | 22-079-701 | size 15 disposable blade |
| Spatula | BRI | 48-1460 | brain spatula |
| Spring scissors | FST | 91500-09 | Student Vannas, 5 mm cutting edge |
| Spring scissors | FST | 15012-12 | Noyes, 14 mm cutting edge |
| STP6000 Smart touch panel | Leica | 11 501 255 | Control Panel |
| Syringe | Hamilton | 80201 | 25 μL Model 1702 Luer Tip syringe |
| Water heater | Adroit | HTP-1500 |
Riferimenti
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