In Vivo Kalsiumavbildning av sensoriske nevroner i rotte trigeminal ganglion

Summary

Genetisk kodede kalsiumindikatorer (GECI) muliggjør en robust, populasjonsnivåanalyse av sensorisk nevronsignalering. Her har vi utviklet en ny tilnærming som muliggjør in vivo GECI-visualisering av rotte trigeminal ganglia neuron aktivitet.

Abstract

Genetisk kodede kalsiumindikatorer (GECI) muliggjør avbildningsteknikker for å overvåke endringer i intracellulært kalsium i målrettede cellepopulasjoner. Deres store signal-støy-forhold gjør GECI til et kraftig verktøy for å oppdage stimulus-fremkalt aktivitet i sensoriske nevroner. GECIs letter populasjonsnivåanalyse av stimuluskoding med antall nevroner som kan studeres samtidig. Denne populasjonskodingen gjøres mest hensiktsmessig in vivo. Dorsal rotganglia (DRG), som huser soma av sensoriske nevroner som innerverer somatiske og viscerale strukturer under nakken, brukes mest omfattende for in vivo-avbildning fordi disse strukturene nås relativt enkelt. Mer nylig ble denne teknikken brukt hos mus for å studere sensoriske nevroner i trigeminal ganglion (TG) som innerverer orale og kraniofaciale strukturer. Det er mange grunner til å studere TG i tillegg til DRG, inkludert den lange listen over smertesyndromer som er spesifikke for orale og kraniofaciale strukturer som ser ut til å gjenspeile endringer i sensorisk nevronaktivitet, som trigeminusnevralgi. Mus brukes mest i studien av DRG- og TG-nevroner på grunn av tilgjengeligheten av genetiske verktøy. Men med forskjeller i størrelse, enkel håndtering og potensielt viktige artsforskjeller, er det grunner til å studere rotte i stedet for mus TG-nevroner. Dermed utviklet vi en tilnærming for avbildning av rotte TG-nevroner in vivo. Vi injiserte nyfødte valper (p2) intraperitonealt med en AAV-kodende GCaMP6s, noe som resulterte i >90% infeksjon av både TG- og DRG-nevroner. TG ble visualisert hos voksne etter kraniotomi og dekortikasjon, og endringer i GCaMP6s fluorescens ble overvåket i TG-nevroner etter stimulering av mandibulære og maksillære regioner i ansiktet. Vi bekreftet at økning i fluorescens var stimulusfremkalt med perifer nerveblokade. Selv om denne tilnærmingen har mange potensielle bruksområder, bruker vi den til å karakterisere underpopulasjonen (e) av TG-nevroner endret etter perifer nerveskade.

Introduction

Somatosensasjon, den nevrale kodingen av mekaniske, termiske og kjemiske stimuli som påvirker huden eller andre kroppslige strukturer, inkludert muskler, bein og innvoller, starter med aktivitet i primære afferente nevroner som innerverer^{disse strukturene}. Enkeltenhetsbaserte elektrofysiologiske tilnærminger har gitt et vell av informasjon om de afferente subtypene som er involvert i denne prosessen, samt hvordan deres stimulusresponsegenskaper kan endres over tid ^1,2,3. Imidlertid, mens det fortsatt er sterke bevis til støtte for den merkede linjeteorien, som antyder at spesifikke sensoriske modaliteter formidles av spesifikke underpopulasjoner av nevroner, antyder evnen til mange underpopulasjoner av nevroner til å reagere på de samme typene mekaniske, termiske og kjemiske stimuli at flertallet av somatosensoriske stimuli er kodet av flere underpopulasjoner av nevroner^{4, 5}. Dermed vil en bedre forståelse av somatosensasjon bare komme med evnen til å studere aktiviteten til 10, om ikke hundrevis, av nevroner samtidig.

Fremskritt i optiske tilnærminger med den relativt nylige adventen av konfokale og senere multifoton og digitale bildebehandlingsteknikker har gjort det lettere å utføre relativt ikke-invasive populasjonsnivåanalyser av nevronaktivitet ^6,7. En av de siste hindringene i anvendelsen av denne teknologien har vært utviklingen av verktøy for å muliggjøre optisk vurdering av nevral aktivitet. Gitt hastigheten til et handlingspotensial som kan starte og slutte på mindre enn et millisekund, vil et spenningsfølsomt fargestoff med kapasitet til å følge endringer i membranpotensial ved hastigheten til et handlingspotensial være det ideelle verktøyet for dette formålet. Men mens det har vært enorm fremgang på dette området ^7,8,9,10, er signal-støy-forholdet for mange av disse fargestoffene fortsatt ikke helt høyt nok til å muliggjøre en populasjonsanalyse av hundrevis av nevroner på enkeltcellenivå. Som en alternativ tilnærming har etterforskere vendt seg til å overvåke endringer i intracellulær Ca²⁺ konsentrasjon ([Ca^{2 +}] _i). Begrensningene med denne strategien har vært klare fra starten og inkluderer det faktum at en økning i [Ca²⁺] _i er et indirekte mål på nevral aktivitet¹¹; at en økning i [Ca²⁺]_i kan forekomme uavhengig av Ca²⁺ tilstrømning assosiert med aktivering av spenningsstyrte Ca²⁺ kanaler (VGCC) ^12,13; at størrelsen og varigheten av en Ca²⁺ forbigående kan styres av prosesser uavhengig av VGCC-aktivitet 11,12,14; og at tidsforløpet til Ca²⁺ transienter langt overstiger et handlingspotensial¹⁵. Likevel er det en rekke betydelige fordeler forbundet med bruk av Ca²⁺ som et indirekte mål for nevral aktivitet. Ikke minst av disse er signal-støy-forholdet forbundet med de fleste Ca²⁺ indikatorer, noe som reflekterer både størrelsen på endringen i intracellulær Ca²⁺ og det faktum at signalet oppstår fra cytosolens tredimensjonale rom i stedet for det todimensjonale rommet til cellemembranen. Videre, med utviklingen av genetisk kodede Ca²⁺ indikatorer (GECI), er det mulig å dra nytte av genetiske strategier for å drive ekspresjonen av Ca²⁺ -indikatorene i spesifikke underpopulasjoner av celler, noe som letter populasjonsnivåanalyser i intakte preparater (f.eks. se¹⁶).

Gitt antall genetiske verktøy som nå er tilgjengelige hos mus, bør det ikke være noen overraskelse at GECI har blitt brukt mest omfattende i denne arten. Muselinjer med konstitutivt GECI-uttrykk i subpopulasjoner av sensoriske nevroner er utviklet ^7,16,17. Med utviklingen av muselinjer som uttrykker rekombinaser i spesifikke celletyper, er det mulig å bruke enda mer sofistikerte strategier for å kontrollere GECI-uttrykk¹⁵. Men mens disse verktøyene blir stadig kraftigere, er det flere grunner til at andre arter, som rotter, kan være mer hensiktsmessige for noen eksperimentelle spørsmål. Disse inkluderer den større størrelsen, noe som letter en rekke eksperimentelle manipulasjoner som er vanskelige, om ikke umulige, i den mindre musen; det enkle å trene rotter i relativt komplekse atferdsoppgaver; Og i det minste noen bevis på at biofysiske egenskaper og uttrykksmønstre av flere ionekanaler i rotte sensoriske nevroner kan være mer lik det som observeres i menneskelige sensoriske nevroner enn de samme kanalene i mus i forhold til mennesket¹⁸.

Mens transduksjon av somatosensoriske stimuli vanligvis forekommer i perifere terminaler av primære afferenter, må aksjonspotensialet initiert i periferien passere gjennom strukturen som huser primær afferente somata, referert til som dorsalrot (DRG) eller trigeminal (TG) ganglier før de når sentralnervesystemet¹⁹. Selv om det er bevis for at ikke alle handlingspotensialer som forplanter seg langs et primært afferente akson, vil invadere cellelegemet²⁰, en konsekvens av det faktum at den primære afferente somata er koblet til hovedafferente aksonet via et T-kryss¹⁹, ser det ut til at flertallet av handlingspotensialene initiert i periferien invaderer soma²¹. Dette gir tre eksperimentelle fordeler ved bruk av GECI for å vurdere populasjonskoding i primære afferenter: den store størrelsen på cellelegemet i forhold til aksonene øker signalet til støy ytterligere ved bruk av [Ca^{2 +}] _i som et indirekte mål på afferente aktivitet; DRG er generelt lett tilgjengelig; Og vurdering av aktivitet på et sted som er romlig fjernt fra de afferente terminalene, minimerer den potensielle effekten av operasjonen som trengs for å eksponere gangliene på stimulus-responsegenskapene til de afferente terminalene. Men fordi TG ligger under hjernen (eller over paletten), er de langt vanskeligere å få tilgang til enn DRG. Videre, mens det er mange likheter mellom DRG og TG nevroner, er det en voksende liste over forskjeller også. Dette inkluderer den grovt sett somatotopiske organiseringen av nevroner i TG²², unike strukturer innervert, forskjellige sentrale terminale termineringsmønstre 23,24,25,26, og nå en voksende liste over forskjeller i både genuttrykk^27,28 og funksjonell reseptoruttrykk²⁹. I tillegg, fordi vi er interessert i identifisering av perifere mekanismer for smerte, antyder det relativt store antallet smertsyndrom som synes å være unikt for trigeminalsystemet (f.eks. Migrene, trigeminusnevralgi, brennende munnsyndrom) som synes å involvere avvikende aktivitet i primære afferenter 30,31,32, at TG må studeres direkte.

Således, mens stimulus-responsegenskapene til TG-nevroner har blitt studert med GECI i musen¹⁶, fordi årsakene nevnt ovenfor tyder på at rotta kan være en mer passende art for å løse en rekke eksperimentelle spørsmål, var formålet med denne studien å utvikle en tilnærming til å bruke GECI til å studere TG-nevroner hos rotter. For å oppnå dette brukte vi en viral tilnærming for å drive uttrykket av GECI GCaMP6s i det perifere nervesystemet. Vi fjernet deretter forhjernen for å gi tilgang til TG. Til slutt ble mekaniske og termiske stimuli påført ansiktet mens nevronresponser ble vurdert under fluorescerende mikroskopi. Sammen støtter disse dataene en rolle for å utnytte rotta til å undersøke endringer i TG under mange stater, og utvide verktøykassen for etterforskere som er interessert i sensorisk koding i trigeminalsystemet.

Protocol

Alle eksperimenter som involverer bruk av dyr i forskning ble utført i samsvar med standarder fastsatt av National Institutes of Health og International Association for the Study of Pain og ble godkjent av University of Pittsburgh Institutional Animal Care and Use Committee (protokoll # 22051100). På slutten av hvert eksperiment ble rotter euthanized via exanguination med hjerteperfusjon av iskald fosfatbufret saltvann (PBS), en tilnærming godkjent av American Veterinary Medical Association og University of Pittsburgh…

Representative Results

Fordi vi tidligere har hatt suksess med AAV9-serotypen for infeksjon av sensoriske nevroner hos rotter15, brukte vi denne serotypen for ekspresjon av GCaMP6s i rotte TG-nevroner. Vi søkte derfor først å vurdere sensorisk nevroninfeksjonseffektivitet av AAV9-CAG-GCaMP6s-WPRE-SV40 (AAV9-GCaMP) da dette viruset ble administrert til nyfødte rotteunger20. Dette viruset bruker CAG-promotoren, som driver og opprettholder høye nivåer av genuttrykk. Videre har AAV9 vist seg å…

Discussion

Her demonstrerer vi en rask, ikke-invasiv måte å generere en GECI-rotte for avbildning av TG. Vi valgte en CAG-promotor for å drive og opprettholde høye nivåer av genuttrykk. Mens tidligere studier tyder på at andre AAV-serotyper effektivt kan drive genuttrykk i DRG-nevroner³⁹, samsvarer resultatene våre med en nylig studie med intraperitoneal injeksjon av AAV hos nyfødte³², noe som indikerer at AAV9-serotypen er svært effektiv ved infeksjon av sensoriske nevroner …

Materials

AAV9-CAG-WPRE-GCaMP6s-SV40	Addgene	100844-AAV9	AAV9-GCaMP6s virus
ACEpromazine maleate	Covetrus	11695-0095-5	10 mg/mL
AnaSed (Xylazine) injection	AKORN Animal Health	23076-35-9	20 mg/mL
CTR5500 Electronics box	Leica	11 888 820	Power Supply
Cutwell burr drill bit	Ransom & Randolph		¼ round
DM 6000 FS	Leica	11 888 928	Base Stand
EL6000	Leica	EL6000	Light source with 120 W mercury bulb
Forceps	FST	11252-00	Dumont No. 05
Friedman rongeurs	FST	16000-14	2.5 mm cup size
Friedman-Pearson rongeurs	FST	16021-14	1 mm cup size
Heating pad (Temperature therapy pad)	STRYKER	8002-062-022
Ketamine hydrochloride	Covetrus	1695-0703-1	100 mg/mL
Plan Fluor 20x/0.40	Leica	MRH00105	20x objective, 0.4 NA10.8 mm WD
Power handle high-temp cautery pen	Bovie	HIT1	handheld Change-A-Tip cautery pen
Prime 95B	Photometrics	Prime 95B	CMOS Camera
Saline	Fisher Scientific	NC0291799	0.9% Sterile Saline
Scalpel blade	Fisher Scientific	22-079-701	size 15 disposable blade
Spatula	BRI	48-1460	brain spatula
Spring scissors	FST	91500-09	Student Vannas, 5 mm cutting edge
Spring scissors	FST	15012-12	Noyes, 14 mm cutting edge
STP6000 Smart touch panel	Leica	11 501 255	Control Panel
Syringe	Hamilton	80201	25 μL Model 1702 Luer Tip syringe
Water heater	Adroit	HTP-1500