Crioconservazione delle cellule germinali primordiali e rinascita dei ceppi di Drosophila
Summary
È altamente auspicabile un metodo di conservazione a lungo termine per i ceppi di Drosophila come alternativa al frequente trasferimento di mosche adulte in fiale di cibo fresco. Questo protocollo descrive la crioconservazione delle cellule germinali primordiali di Drosophila e la rinascita del ceppo attraverso il loro trapianto in embrioni ospiti agametici.
Abstract
I ceppi di Drosophila devono essere mantenuti mediante il frequente trasferimento di mosche adulte in fiale nuove. Ciò comporta il pericolo di deterioramento mutazionale e cambiamenti fenotipici. Lo sviluppo di un metodo alternativo per la conservazione a lungo termine senza tali modifiche è quindi imperativo. Nonostante i precedenti tentativi di successo, la crioconservazione degli embrioni di Drosophila non è ancora di uso pratico a causa della bassa riproducibilità. Qui, descriviamo un protocollo per la crioconservazione delle cellule germinali primordiali (PGC) e la rinascita del ceppo tramite trapianto di PGC crioconservate in embrioni ospiti agametici di Drosophila melanogaster (D. melanogaster). Le PGC sono altamente permeabili agli agenti crioprotettivi (CPA) e la variazione evolutiva e morfologica tra i ceppi è meno problematica rispetto alla crioconservazione degli embrioni. In questo metodo, le PGC vengono raccolte da circa 30 embrioni donatori, caricate in un ago dopo il trattamento CPA e quindi crioconservate in azoto liquido. Per produrre gameti derivati da donatori, le PGC crioconservate in un ago vengono scongelate e quindi depositate in circa 15 embrioni ospiti agagametici. Con questo protocollo è stata raggiunta una frequenza di almeno il 15% di moscerini fertili e il numero di progenie per coppia fertile è sempre stato più che sufficiente per far rivivere il ceppo originale (il numero medio di progenie è stato di 77,2 ± 7,1), indicando la capacità delle PGC crioconservate di diventare cellule staminali germinali. Il numero medio di mosche fertili per ago era di 1,1 ± 0,2 e 9 aghi su 26 hanno prodotto due o più progenie fertile. Si è scoperto che 11 aghi sono sufficienti per produrre 6 o più progenie, in cui è probabile che siano inclusi almeno una femmina e un maschio. L’ospite agagametico permette di ravvivare rapidamente il ceppo semplicemente incrociando mosche femmine e maschi appena emerse. Inoltre, le PGC hanno il potenziale per essere utilizzate in applicazioni di ingegneria genetica, come l’editing del genoma.
Introduction
Il mantenimento dei ceppi di Drosophila mediante il trasferimento di mosche adulte in nuove fiale di cibo comporta inevitabilmente l’accumulo di mutazioni e cambiamenti epigenetici nel tempo. Lo sviluppo di un metodo alternativo per il mantenimento a lungo termine dei ceppi di Drosophila senza tali cambiamenti è imperativo, soprattutto per i ceppi di riferimento in cui l’intero genoma deve essere mantenuto. Sono stati descritti diversi tentativi riusciti di crioconservare embrioni o ovaie di Drosophila 1,2,3. Sfortunatamente, non sono ancora di uso pratico a causa della bassa riproducibilità. Infatti, gli embrioni in fase iniziale hanno un basso tasso di sopravvivenza dopo la crioconservazione a causa del loro alto contenuto di tuorlo, che impedisce la permeazione e la diffusione dell’agente crioprotettivo (CPA) 2,3. La permeabilità al CPA è anche fortemente limitata dagli strati cerosi degli embrioni in fase avanzata. È difficile e dispendioso in termini di tempo trovare un periodo di tempo specifico per ceppo in cui gli embrioni abbiano un alto tasso di sopravvivenza e uno strato di cera più sottile. Recentemente, Zhan et al.4 hanno migliorato i metodi per la permeabilizzazione degli embrioni, il carico di CPA e la vitrificazione e hanno crioconservato con successo embrioni di ceppi multipli. Tuttavia, i metodi non sono facili da applicare perché la vitalità degli embrioni dopo la permeabilizzazione tende ad essere scarsa. Pertanto, sono ancora necessari ulteriori miglioramenti e lo sviluppo di approcci alternativi. I metodi che prevedono la crioconservazione delle cellule germinali primordiali (PGC) sono un approccio alternativo per il mantenimento a lungo termine dei ceppi di Drosophila.
Il trapianto di PGC (chiamato anche cellula polare) è stato utilizzato per generare chimere germinali, in particolare femmine, per studiare processi come gli effetti materni delle mutazioni letali zigotiche e la determinazione del sesso delle cellule germinali 5,6,7,8,9,10,11,12 . Le PGC sono molto più piccole degli embrioni e sono probabilmente altamente permeabili alla maggior parte dei crioprotettori. Inoltre, la variazione evolutiva e morfologica tra i ceppi è meno problematica e un ospite agametico consente un rapido ripristino di interi genomi. Recentemente abbiamo sviluppato un nuovo metodo di crioconservazione PGC13, che previene i cambiamenti genetici ed epigenetici altrimenti inevitabili nei ceppi di Drosophila. Qui presentiamo il protocollo dettagliato.
Questo metodo di crioconservazione richiede competenze specifiche nella manipolazione e nella strumentazione delle PGC. Mentre un approccio graduale può essere una soluzione efficiente per coloro che non hanno familiarità con esso, potrebbe non essere adatto per i piccoli laboratori a causa dei requisiti della strumentazione. Questo protocollo di crioconservazione PGC può essere adattato più facilmente per l’uso con diverse specie di Drosophila e diverse specie di insetti rispetto ai protocolli di crioconservazione degli embrioni a causa delle minori differenze di sviluppo e morfologiche. Le PGC possono anche essere potenzialmente utilizzate in applicazioni di ingegneria genetica, come l’editing del genoma 14,15,16. In sintesi, questo metodo può essere utilizzato nei centri di stoccaggio e in altri laboratori per mantenere mosche e altri ceppi di insetti per periodi di tempo prolungati senza cambiamenti.
Protocol
Representative Results
Discussion
Un fattore critico per il successo nella crioconservazione e nella rianimazione delle PGC è l’utilizzo di embrioni buoni. Le femmine giovani (ad esempio, da 3 a 5 giorni) dovrebbero essere utilizzate per la raccolta degli embrioni. Sia gli embrioni donati che quelli ospiti vengono valutati mediante ispezione microscopica e vengono utilizzati solo quelli allo stadio di blastoderma (stadio 5)12. Per la raccolta di PGC, di solito allineiamo circa 40 embrioni donati in un periodo di 20 minuti e racco…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo il KYOTO Drosophila Stock Center per i ceppi di mosca. Ringraziamo anche la signora Wanda Miyata per l’editing in lingua inglese del manoscritto e il Dr. Jeremy Allen di Edanz (https://jp.edanz.com/ac) per aver curato una bozza di questo manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni (JP16km0210072, JP17km0210146, JP18km0210146) dall’Agenzia giapponese per la ricerca e lo sviluppo medico (AMED) a T.T.-S.-K., sovvenzioni (JP16km0210073, JP17km0210147, JP18km0210145) da AMED a S.K., una sovvenzione (JP20km0210172) da AMED a T.T.-S.-K. e S.K., una sovvenzione per la ricerca scientifica (C) (JP19K06780) della Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) a T.T.-S.-K., e una sovvenzione per la ricerca scientifica in aree innovative (JP18H05552) da JSPS a S.K.
Materials
| Acetic acid | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 017-00256 | For embryo collection |
| Agar powder | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 010-08725 | For embryo collection |
| Calcium chloride | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 038-24985 | For EBR solution |
| Capillary | Sutter Instrument | B100-75-10-PT | BOROSILICATE GLASS; O.D: 1.0mm, I.D: 0.75mm , length: 10cm, 225Pcs |
| Capillary holder | Eppendorf | 5196 081.005 | Capillary holder 4; for micromanipulation |
| Chromic acid mixture | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 037-05415 | For needle washing |
| CPA solution | 1x EBR containing 20% ethylene glycol and 1M sucrose | ||
| Double-sided tape | 3M | Scotch w-12 | For glue extracting |
| Ephrussi–Beadle Ringer solution (EBR) | 130 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, and 10 mM Hepes at pH 6.9 | ||
| Ethanol (99.5) | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 057-00451 | For embryo collection |
| Ethylene glycol | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 054-00983 | For CPA solution |
| Falcon 50 mm x 9 mm bacteriological petri dish | Corning Inc. | 351006 | For embryo collection |
| Forceps | Vigor | Type5 Titan | For embryo handling |
| Grape juice | Asahi Soft Drinks Co., LTD. | Welch's Grape 100 | For embryo collection |
| Grape juice agar plate | 50% grape juice, 2% agar, 1% ethanol, 1% acetic acid | ||
| Heptane | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 084-08105 | For glue extracting |
| Humidifier | APIX INTERNATIONAL CO., LTD. | FSWD2201-WH | For embryo preparation |
| Inverted microscope | Leica Microsystems GmbH | Leica DM IL LED | For micromanipulation |
| Luer-lock glass syringe | Tokyo Garasu Kikai Co., Ltd. | 0550 14 71 08 | Coat a plunger with silicon oil (FL-100-450CS);for micromanipulation |
| Mechanical micromanipulator | Leica Microsystems GmbH | For micromanipulation | |
| Micro slide glass | Matsunami Glass Ind., Ltd. | S-2441 | For embryo aligning |
| Microgrinder | NARISHIGE Group | Custom order | EG-401-S combined EG-401 and MF2 (with ocular lens MF2-LE15 ); for needle preparation |
| Microscope camera | Leica Microsystems GmbH | Leica MC170 HD | For micromanipulation |
| Needle holder | Merck KGaA | Eppendorf TransferTip (ES) | For cryopreservation |
| Potassium chloride | Nacalai Tesque, Inc. | 28514-75 | For EBR solution |
| Puller | NARISHIGE Group | PN-31 | For needle preparation; the heater level is set to 85.0-98.4, the magnet main level to 57.8, and the magnet sub level to 45.0. |
| PVC adhesive tape for electric insulation | Nitto Denko Corporation | J2515 | For embryo-pool frame |
| Silicon oil | Shin-Etsu Chemical, Co, Ltd. | FL-100-450CS | For embryo handling |
| Sodium chloride | Nacalai Tesque, Inc. | 31320-05 | For EBR solution |
| Sodium hypochlorite solution | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 197-02206 | Undiluted and freshly prepared; for embryo breaching |
| Sucrose | Nacalai Tesque, Inc. | 30404-45 | For CPA solution |
Riferimenti
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