Primordial Germ Cell Cryopreservation and Revival of Drosophila Strains(초파리 균주의 원시 생식세포 냉동 보존 및 부활)
Summary
성충 파리를 신선한 식품 바이알로 자주 옮기는 것에 대한 대안으로 초파리 균주에 대한 장기 보존 방법은 매우 바람직합니다. 이 프로토콜은 초파리 원시 생식 세포의 동결 보존과 무생식 숙주 배아로의 이식을 통한 균주 부활을 설명합니다.
Abstract
초파리 균주는 성충 파리를 새 유리병으로 자주 옮겨 유지해야 합니다. 이것은 돌연변이 악화 및 표현형 변화의 위험을 수반합니다. 따라서 이러한 변화 없이 장기 보존을 위한 대체 방법을 개발하는 것이 필수적입니다. 이전의 성공적인 시도에도 불구하고 초파리 배아의 냉동 보존은 낮은 재현성으로 인해 여전히 실용적이지 않습니다. 여기서는 동결 보존된 PGC를 agametic Drosophila melanogaster (D. melanogaster) 숙주 배아에 이식하여 원시 생식 세포(PGC) 동결 보존 및 균주 부활을 위한 프로토콜을 설명합니다. PGC는 동결보호제(CPA)에 대한 투과성이 높으며, 균주 간의 발달 및 형태학적 변이는 배아 동결 보존보다 문제가 적습니다. 이 방법에서는 약 30개의 기증자 배아에서 PGC를 수집하여 CPA 처리 후 바늘에 삽입한 다음 액체 질소에서 냉동 보존합니다. 기증자 유래 배우자를 생산하기 위해 바늘에서 동결 보존된 PGC를 해동한 다음 약 15개의 비생식 숙주 배아에 증착합니다. 이 프로토콜로 최소 15%의 번식 가능한 파리의 빈도를 달성했으며, 가임 부부당 자손 수는 항상 원래 균주를 되살리기에 충분하고도 남았으며(평균 자손 수는 77.2 ± 7.1), 이는 동결 보존된 PGC가 생식세포 줄기세포가 될 수 있는 능력을 나타냅니다. 바늘 당 평균 번식 가능 파리 수는 1.1 ± 0.2 개였으며 26 개의 바늘 중 9 개는 2 개 이상의 번식 가능한 자손을 낳았습니다. 11개의 바늘은 6개 이상의 자손을 낳기에 충분하며, 적어도 한 마리의 암컷과 한 마리의 수컷이 포함될 가능성이 있음이 밝혀졌습니다. agametic 숙주는 새로 출현한 암컷과 수컷 파리를 교배하는 것만으로도 균주를 빠르게 되살릴 수 있습니다. 또한 PGC는 게놈 편집과 같은 유전 공학 응용 분야에 사용될 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다.
Introduction
성충 파리를 새로운 먹이 바이알로 옮겨 초파리 균주를 유지하는 것은 필연적으로 시간이 지남에 따라 돌연변이와 후성유전학적 변화의 축적을 초래합니다. 이러한 변화 없이 초파리 균주를 장기간 유지하기 위한 대체 방법의 개발은 필수적이며, 특히 전체 게놈을 유지해야 하는 참조 균주의 경우 더욱 그렇습니다. 초파리 배아 또는 난소를 냉동 보존하기 위한 몇 가지 성공적인 시도가 기술되었습니다 1,2,3. 불행히도 재현성이 낮기 때문에 여전히 실용적이지 않습니다. 실제로, 초기 단계의 배아는 난황 함량이 높기 때문에 냉동 보존 후 생존율이 낮으며, 이는 동결 보호제(CPA) 투과 및 확산을 방해합니다 2,3. CPA 투과성은 또한 후기 단계 배아의 왁스 층에 의해 심각하게 제한됩니다. 배아의 생존율이 높고 왁스 층이 더 얇은 균주별 기간을 찾는 것은 어렵고 시간이 많이 걸립니다. 최근 Zhan et al.4은 배아 투과화, CPA 로딩 및 유리화 방법을 개선하고 여러 균주의 배아를 성공적으로 냉동 보존했습니다. 그러나 투과화 후 배아의 생존력이 떨어지는 경향이 있기 때문에 방법을 적용하기가 쉽지 않습니다. 따라서 대안적 접근법의 추가 개선과 개발이 여전히 필요합니다. 원시 생식 세포(PGC)의 동결 보존과 관련된 방법은 초파리 균주의 장기 유지를 위한 대안적인 접근 방식입니다.
PGC(극 세포라고도 함) 이식은 접합 치사 돌연변이의 모계 효과 및 생식 세포의 성별 결정과 같은 과정을 연구하기 위해 생식세포 키메라, 특히 암컷을 생성하는 데 사용되었습니다 5,6,7,8,9,10,11,12 . PGC는 배아보다 훨씬 작으며 대부분의 동결 보호제에 대한 투과성이 높을 수 있습니다. 또한, 균주 간의 발달 및 형태학적 변이는 문제가 적으며, 무생식 숙주는 전체 게놈의 빠른 복원을 가능하게 합니다. 당사는 최근 PGC 동결 보존의 새로운 방법을 개발했으며,이는 초파리 균주에서 불가피한 유전적 및 후성유전학적 변화를 방지합니다. 여기에서는 자세한 프로토콜을 제시합니다.
이 냉동 보존 방법은 PGC 취급 및 기기에 대한 특정 전문 지식이 필요합니다. 단계별 접근 방식은 익숙하지 않은 사람들에게는 효율적인 솔루션일 수 있지만 기기 요구 사항으로 인해 소규모 실험실에는 적합하지 않을 수 있습니다. 이 PGC 동결 보존 프로토콜은 발달 및 형태학적 차이가 더 작기 때문에 배아 동결 보존 프로토콜보다 다른 초파리 종 및 다른 곤충 종에 사용하도록 더 쉽게 조정할 수 있습니다. PGC는 게놈 편집(genome editing)과 같은 유전 공학 응용 분야에서도 잠재적으로 사용될 수 있다 14,15,16. 요약하면, 이 방법은 재고 센터 및 기타 실험실에서 파리 및 기타 곤충 균주를 변경 없이 장기간 유지하는 데 사용할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
PGC 냉동 보존 및 소생의 성공을 위한 중요한 요소는 좋은 배아를 사용하는 것입니다. 어린 암컷(예: 생후 3-5일)은 배아 채취에 사용해야 합니다. 기증자 배아와 숙주 배아 모두 현미경 검사로 평가되며, 배배엽 단계(5기)에 있는 배아만 사용한다12. PGC 채취의 경우, 보통 20분 동안 약 40개의 기증자 배아를 정렬하고 초기 5단계에서 약 30개의 배아에서 PGC를 채취합니다. 더 오래되고 ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 파리 균주에 대해 KYOTO Drosophila Stock Center에 감사드립니다. 또한 원고의 영문 편집에 대해 Ms. Wanda Miyata와 이 원고의 초안을 편집해 준 Edanz(https://jp.edanz.com/ac)의 Jeremy Allen 박사에게도 감사드립니다. 이 연구는 일본 의학 연구 개발기구(AMED)가 T.T.-S.-K.에 보조금(JP16km0210072, JP17km0210146, JP18km0210146)을, AMED에서 S.K.에 보조금(JP16km0210073, JP17km0210147, JP18km0210145)을, AMED에서 T.T.-S.-K.에 보조금(JP20km0210172)을 지원했습니다. 및 S.K., 일본 과학 진흥 협회 (JSPS)에서 T.T.-S.-K.에 대한 과학 연구 보조금 (C) (JP19K06780) 및 JSPS에서 S.K.에 대한 혁신 분야에 대한 과학 연구 보조금 (JP18H05552)
Materials
| Acetic acid | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 017-00256 | For embryo collection |
| Agar powder | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 010-08725 | For embryo collection |
| Calcium chloride | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 038-24985 | For EBR solution |
| Capillary | Sutter Instrument | B100-75-10-PT | BOROSILICATE GLASS; O.D: 1.0mm, I.D: 0.75mm , length: 10cm, 225Pcs |
| Capillary holder | Eppendorf | 5196 081.005 | Capillary holder 4; for micromanipulation |
| Chromic acid mixture | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 037-05415 | For needle washing |
| CPA solution | 1x EBR containing 20% ethylene glycol and 1M sucrose | ||
| Double-sided tape | 3M | Scotch w-12 | For glue extracting |
| Ephrussi–Beadle Ringer solution (EBR) | 130 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, and 10 mM Hepes at pH 6.9 | ||
| Ethanol (99.5) | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 057-00451 | For embryo collection |
| Ethylene glycol | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 054-00983 | For CPA solution |
| Falcon 50 mm x 9 mm bacteriological petri dish | Corning Inc. | 351006 | For embryo collection |
| Forceps | Vigor | Type5 Titan | For embryo handling |
| Grape juice | Asahi Soft Drinks Co., LTD. | Welch's Grape 100 | For embryo collection |
| Grape juice agar plate | 50% grape juice, 2% agar, 1% ethanol, 1% acetic acid | ||
| Heptane | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 084-08105 | For glue extracting |
| Humidifier | APIX INTERNATIONAL CO., LTD. | FSWD2201-WH | For embryo preparation |
| Inverted microscope | Leica Microsystems GmbH | Leica DM IL LED | For micromanipulation |
| Luer-lock glass syringe | Tokyo Garasu Kikai Co., Ltd. | 0550 14 71 08 | Coat a plunger with silicon oil (FL-100-450CS);for micromanipulation |
| Mechanical micromanipulator | Leica Microsystems GmbH | For micromanipulation | |
| Micro slide glass | Matsunami Glass Ind., Ltd. | S-2441 | For embryo aligning |
| Microgrinder | NARISHIGE Group | Custom order | EG-401-S combined EG-401 and MF2 (with ocular lens MF2-LE15 ); for needle preparation |
| Microscope camera | Leica Microsystems GmbH | Leica MC170 HD | For micromanipulation |
| Needle holder | Merck KGaA | Eppendorf TransferTip (ES) | For cryopreservation |
| Potassium chloride | Nacalai Tesque, Inc. | 28514-75 | For EBR solution |
| Puller | NARISHIGE Group | PN-31 | For needle preparation; the heater level is set to 85.0-98.4, the magnet main level to 57.8, and the magnet sub level to 45.0. |
| PVC adhesive tape for electric insulation | Nitto Denko Corporation | J2515 | For embryo-pool frame |
| Silicon oil | Shin-Etsu Chemical, Co, Ltd. | FL-100-450CS | For embryo handling |
| Sodium chloride | Nacalai Tesque, Inc. | 31320-05 | For EBR solution |
| Sodium hypochlorite solution | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 197-02206 | Undiluted and freshly prepared; for embryo breaching |
| Sucrose | Nacalai Tesque, Inc. | 30404-45 | For CPA solution |
Riferimenti
- Brüschweiler, W., Gehring, W. A method for freezing living ovaries of Drosophila melanogaster larvae and its application to the storage of mutant stocks. Experientia. 29, 134-135 (1973).
- Steponkus, P. L., et al. Cryopreservation of Drosophila melanogaster embryos. Nature. 345, 170-172 (1990).
- Mazur, P., Cole, K. W., Hall, J. W., Schreuders, P. D., Mahowald, A. P. Cryobiological preservation of Drosophila embryos. Science. 258 (5090), 1932-1935 (1992).
- Zhan, L., Li, M. G., Hays, T., Bischof, J. Cryopreservation method for Drosophila melanogaster embryos. Nat Comm. 12, 2412 (2021).
- Van Deusen, E. B. Sex determination in germ line chimeras of Drosophila melanogaster. Development. 37 (1), 173-185 (1977).
- Breen, T. R., Duncan, I. M. Maternal expression of genes that regulate the bithorax complex of Drosophila melanogaster. Dev Biol. 118, 442-456 (1986).
- Schupbach, T., Wieschaus, E. Germline autonomy of maternal-effect mutations altering the embryonic body pattern of Drosophila. Dev Biol. 113, 443-448 (1986).
- Irish, V., Lehmann, R., Akam, M. The Drosophila posterior-group gene nanos functions by repressing hunchback activity. Nature. 338, 646-648 (1989).
- Hülskamp, M., Schröder, C., Pfeifle, C., Jäckle, H., Tautz, D. Posterior segmentation of the Drosophila embryo in the absence of a maternal posterior organizer gene. Nature. 338, 629-632 (1989).
- Steinmann-Zwicky, M., Schmid, H., Nöthiger, R. Cell-autonomous and inductive signals can determine the sex of the germ line of Drosophila by regulating the gene Sxl. Cell. 57 (1), 157-166 (1989).
- Stein, D., Roth, S., Vogelsang, E., Nüsslein-Volhard, C. The polarity of the dorsoventral axis in the drosophila embryo is defined by an extracellular signal. Cell. 65 (5), 725-735 (1991).
- Kobayashi, S., Yamada, M., Asaoka, M., Kitamura, T. Essential role of the posterior morphogen nanos for germline development in Drosophila. Nature. 380, 708-711 (1996).
- Asaoka, M., et al. Offspring production from cryopreserved primordial germ cells in Drosophila. Comm Biol. 4 (1), 1159 (2021).
- Blitz, I. L., Fish, M. B., Cho, K. W. Y. Leapfrogging: primordial germ cell transplantation permits recovery of CRISPR/Cas9-induced mutations in essential genes. Development. 143 (15), 2868-2875 (2016).
- Koslová, A., et al. Precise CRISPR/Cas9 editing of the NHE1 gene renders chickens resistant to the J subgroup of avian leukosis virus. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (4), 2108-2112 (2020).
- Zhang, F. Efficient generation of zebrafish maternal-zygotic mutants through transplantation of ectopically induced and Cas9/gRNA targeted primordial germ cells. J Genet Genom. 47 (1), 37-47 (2020).
- Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. Stages of Drosophila Embryogenesis. The Embryonic Development of Drosophila. , (1997).
- Manning, A. A sperm factor affecting the receptivity of Drosophila melanogaster females. Nature. 194, 252-253 (1962).
- Kubli, E. Sex-peptides: seminal peptides of the Drosophila male. Cell Mol Life Sci. 60, 1689-1704 (2003).
- Lehmann, R., Nüsslein-Volhard, C. Abdominal segmentation, pole cell formation, and embryonic polarity require the localized activity of oskar, a maternal gene in drosophila. Cell. 47 (1), 141-152 (1986).
- Kiger, A. A., Gigliotti, S., Fuller, M. T. Developmental genetics of the essential Drosophila Nucleoporin nup154: allelic differences due to an outward-directed promoter in the P-element 3′ end. Genetica. 153 (2), 799-812 (1999).
- Rienzi, L. F., et al. Perspectives in gamete and embryo cryopreservation. Semin Reprod Med. 36 (5), 253-264 (2018).
