Primordial cellkryokonservering och återupplivande av Drosophila-stammar
Summary
En långsiktig konserveringsmetod för Drosophila-stammar som ett alternativ till den frekventa överföringen av vuxna flugor till färskfoderflaskor är mycket önskvärd. Detta protokoll beskriver kryokonservering av Drosophila primordiala könsceller och stamåterupplivning via deras transplantation till agametiska värdembryon.
Abstract
Drosophila-stammar måste upprätthållas genom frekvent överföring av vuxna flugor till nya injektionsflaskor. Detta medför en risk för mutationsförsämring och fenotypiska förändringar. Det är därför absolut nödvändigt att utveckla en alternativ metod för långtidsbevarande utan sådana förändringar. Trots tidigare framgångsrika försök är kryokonservering av Drosophila-embryon fortfarande inte till praktisk nytta på grund av låg reproducerbarhet. Här beskriver vi ett protokoll för kryokonservering av primordiala könsceller (PGC) och stamåterupplivning via transplantation av kryokonserverade PGC:er till agametiska Drosophila melanogaster (D. melanogaster) värdembryon. PGC:er är mycket permeabla för kryoprotektiva medel (CPA), och utvecklingsmässig och morfologisk variation mellan stammar är mindre problematisk än vid kryokonservering av embryon. I denna metod samlas PGC in från cirka 30 donatorembryon, laddas i en nål efter CPA-behandling och kryokonserveras sedan i flytande kväve. För att producera könsceller från donatorer tinas de kryokonserverade PGC:erna i en nål och deponeras sedan i cirka 15 agametiska värdembryon. En frekvens på minst 15 % fertila flugor uppnåddes med detta protokoll, och antalet avkommor per fertilt par var alltid mer än tillräckligt för att återuppliva den ursprungliga stammen (det genomsnittliga antalet avkommor var 77,2 ± 7,1), vilket indikerar förmågan hos kryokonserverade PGC:er att bli stamceller från könsceller. Det genomsnittliga antalet fertila flugor per nål var 1,1 ± 0,2, och 9 av 26 nålar producerade två eller fler fertila avkommor. Det visade sig att 11 nålar är tillräckligt för att producera 6 eller fler avkommor, i vilka minst en hona och en hane sannolikt ingår. Den agametiska värden gör det möjligt att snabbt återuppliva stammen genom att helt enkelt korsa nyuppkomna hon- och hanflugor. Dessutom har PGC potential att användas i gentekniska tillämpningar, såsom genredigering.
Introduction
Upprätthållandet av Drosophila-stammar genom överföring av vuxna flugor till nya matflaskor resulterar oundvikligen i ackumulering av mutationer och epigenetiska förändringar över tid. Det är absolut nödvändigt att utveckla en alternativ metod för långsiktigt underhåll av Drosophila-stammar utan sådana förändringar, särskilt för referensstammar där hela genomet måste bevaras. Flera lyckade försök att kryokonservera Drosophila-embryon eller äggstockar har beskrivits 1,2,3. Tyvärr är de fortfarande inte till praktisk nytta på grund av låg reproducerbarhet. Faktum är att embryon i tidiga stadier har en låg överlevnadsgrad efter kryokonservering på grund av deras höga innehåll av äggulor, vilket hindrar kryoskyddande medel (CPA) genomträngning och diffusion 2,3. CPA-permeabiliteten är också starkt begränsad av de vaxartade skikten hos embryon i sent stadium. Det är svårt och tidskrävande att hitta en stamspecifik tidsperiod där embryon har en hög överlevnadsgrad och ett tunnare vaxlager. Nyligen förbättrade Zhan et al.4 metoder för embryopermeabilisering, CPA-laddning och vitrifiering och kryokonserverade framgångsrikt embryon av flera stammar. Metoderna är dock inte lätta att tillämpa eftersom embryonas livsduglighet efter permeabilisering tenderar att vara dålig. Därför behövs det fortfarande ytterligare förbättringar och utveckling av alternativa metoder. Metoder som involverar kryokonservering av primordiala könsceller (PGC) är ett alternativt tillvägagångssätt för långsiktigt underhåll av Drosophila-stammar.
PGC-transplantation (även kallad polcellstransplantation) har använts för att generera könsceller, särskilt honor, för att studera processer som maternella effekter av zygotiska letala mutationer och könsbestämning av könsceller 5,6,7,8,9,10,11,12 . PGC är mycket mindre än embryon och är sannolikt mycket permeabla för de flesta kryoprotektiva medel. Dessutom är utvecklingsmässig och morfologisk variation mellan stammar mindre problematisk, och en agametisk värd möjliggör snabb restaurering av hela genom. Vi har nyligen utvecklat en ny metod för PGC-kryokonservering13, som förhindrar de annars oundvikliga genetiska och epigenetiska förändringarna i Drosophila-stammar. Här presenterar vi det detaljerade protokollet.
Denna kryokonserveringsmetod kräver specifik expertis inom PGC-hantering och instrumentering. Även om ett steg-för-steg-tillvägagångssätt kan vara en effektiv lösning för dem som inte är bekanta med det, kan det vara olämpligt för små laboratorier på grund av instrumentkrav. Detta PGC-kryokonserveringsprotokoll kan lättare anpassas för användning med olika Drosophila-arter och olika insektsarter än embryokryokonserveringsprotokoll på grund av mindre utvecklingsmässiga och morfologiska skillnader. PGC kan också potentiellt användas i gentekniska tillämpningar, såsom genomredigering 14,15,16. Sammanfattningsvis kan denna metod användas i beståndscentra och andra laboratorier för att upprätthålla flugor och andra insektsstammar under längre perioder utan förändringar.
Protocol
Representative Results
Discussion
En kritisk faktor för framgång i PGC-kryokonservering och återupplivning är att använda bra embryon. Unga honor (t.ex. 3 till 5 dagar gamla) bör användas för embryoinsamling. Både donator- och värdembryon bedöms genom mikroskopisk inspektion, och endast de som befinner sig i blastodermstadiet (stadium 5) används12. För PGC-insamling anpassar vi vanligtvis cirka 40 donatorembryon under en 20-minutersperiod och samlar in PGC från cirka 30 embryon i ett tidigt skede 5; Äldre och defekt…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar KYOTO Drosophila Stock Center för flugstammar. Vi tackar också Wanda Miyata för engelskspråkig redigering av manuskriptet och Dr. Jeremy Allen från Edanz (https://jp.edanz.com/ac) för redigering av ett utkast av detta manuskript. Detta arbete stöddes av anslag (JP16km0210072, JP17km0210146, JP18km0210146) från Japan Agency for Medical Research and Development (AMED) till T.T.-S.-K., anslag (JP16km0210073, JP17km0210147, JP18km0210145) från AMED till S.K., ett bidrag (JP20km0210172) från AMED till T.T.-S.-K. och S.K., ett bidrag till stöd för vetenskaplig forskning (C) (JP19K06780) från Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) till T.T.-S.-K., och ett bidrag till stöd för vetenskaplig forskning inom innovativa områden (JP18H05552) från JSPS till S.K.
Materials
| Acetic acid | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 017-00256 | For embryo collection |
| Agar powder | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 010-08725 | For embryo collection |
| Calcium chloride | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 038-24985 | For EBR solution |
| Capillary | Sutter Instrument | B100-75-10-PT | BOROSILICATE GLASS; O.D: 1.0mm, I.D: 0.75mm , length: 10cm, 225Pcs |
| Capillary holder | Eppendorf | 5196 081.005 | Capillary holder 4; for micromanipulation |
| Chromic acid mixture | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 037-05415 | For needle washing |
| CPA solution | 1x EBR containing 20% ethylene glycol and 1M sucrose | ||
| Double-sided tape | 3M | Scotch w-12 | For glue extracting |
| Ephrussi–Beadle Ringer solution (EBR) | 130 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, and 10 mM Hepes at pH 6.9 | ||
| Ethanol (99.5) | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 057-00451 | For embryo collection |
| Ethylene glycol | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 054-00983 | For CPA solution |
| Falcon 50 mm x 9 mm bacteriological petri dish | Corning Inc. | 351006 | For embryo collection |
| Forceps | Vigor | Type5 Titan | For embryo handling |
| Grape juice | Asahi Soft Drinks Co., LTD. | Welch's Grape 100 | For embryo collection |
| Grape juice agar plate | 50% grape juice, 2% agar, 1% ethanol, 1% acetic acid | ||
| Heptane | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 084-08105 | For glue extracting |
| Humidifier | APIX INTERNATIONAL CO., LTD. | FSWD2201-WH | For embryo preparation |
| Inverted microscope | Leica Microsystems GmbH | Leica DM IL LED | For micromanipulation |
| Luer-lock glass syringe | Tokyo Garasu Kikai Co., Ltd. | 0550 14 71 08 | Coat a plunger with silicon oil (FL-100-450CS);for micromanipulation |
| Mechanical micromanipulator | Leica Microsystems GmbH | For micromanipulation | |
| Micro slide glass | Matsunami Glass Ind., Ltd. | S-2441 | For embryo aligning |
| Microgrinder | NARISHIGE Group | Custom order | EG-401-S combined EG-401 and MF2 (with ocular lens MF2-LE15 ); for needle preparation |
| Microscope camera | Leica Microsystems GmbH | Leica MC170 HD | For micromanipulation |
| Needle holder | Merck KGaA | Eppendorf TransferTip (ES) | For cryopreservation |
| Potassium chloride | Nacalai Tesque, Inc. | 28514-75 | For EBR solution |
| Puller | NARISHIGE Group | PN-31 | For needle preparation; the heater level is set to 85.0-98.4, the magnet main level to 57.8, and the magnet sub level to 45.0. |
| PVC adhesive tape for electric insulation | Nitto Denko Corporation | J2515 | For embryo-pool frame |
| Silicon oil | Shin-Etsu Chemical, Co, Ltd. | FL-100-450CS | For embryo handling |
| Sodium chloride | Nacalai Tesque, Inc. | 31320-05 | For EBR solution |
| Sodium hypochlorite solution | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 197-02206 | Undiluted and freshly prepared; for embryo breaching |
| Sucrose | Nacalai Tesque, Inc. | 30404-45 | For CPA solution |
References
- Brüschweiler, W., Gehring, W. A method for freezing living ovaries of Drosophila melanogaster larvae and its application to the storage of mutant stocks. Experientia. 29, 134-135 (1973).
- Steponkus, P. L., et al. Cryopreservation of Drosophila melanogaster embryos. Nature. 345, 170-172 (1990).
- Mazur, P., Cole, K. W., Hall, J. W., Schreuders, P. D., Mahowald, A. P. Cryobiological preservation of Drosophila embryos. Science. 258 (5090), 1932-1935 (1992).
- Zhan, L., Li, M. G., Hays, T., Bischof, J. Cryopreservation method for Drosophila melanogaster embryos. Nat Comm. 12, 2412 (2021).
- Van Deusen, E. B. Sex determination in germ line chimeras of Drosophila melanogaster. Development. 37 (1), 173-185 (1977).
- Breen, T. R., Duncan, I. M. Maternal expression of genes that regulate the bithorax complex of Drosophila melanogaster. Dev Biol. 118, 442-456 (1986).
- Schupbach, T., Wieschaus, E. Germline autonomy of maternal-effect mutations altering the embryonic body pattern of Drosophila. Dev Biol. 113, 443-448 (1986).
- Irish, V., Lehmann, R., Akam, M. The Drosophila posterior-group gene nanos functions by repressing hunchback activity. Nature. 338, 646-648 (1989).
- Hülskamp, M., Schröder, C., Pfeifle, C., Jäckle, H., Tautz, D. Posterior segmentation of the Drosophila embryo in the absence of a maternal posterior organizer gene. Nature. 338, 629-632 (1989).
- Steinmann-Zwicky, M., Schmid, H., Nöthiger, R. Cell-autonomous and inductive signals can determine the sex of the germ line of Drosophila by regulating the gene Sxl. Cell. 57 (1), 157-166 (1989).
- Stein, D., Roth, S., Vogelsang, E., Nüsslein-Volhard, C. The polarity of the dorsoventral axis in the drosophila embryo is defined by an extracellular signal. Cell. 65 (5), 725-735 (1991).
- Kobayashi, S., Yamada, M., Asaoka, M., Kitamura, T. Essential role of the posterior morphogen nanos for germline development in Drosophila. Nature. 380, 708-711 (1996).
- Asaoka, M., et al. Offspring production from cryopreserved primordial germ cells in Drosophila. Comm Biol. 4 (1), 1159 (2021).
- Blitz, I. L., Fish, M. B., Cho, K. W. Y. Leapfrogging: primordial germ cell transplantation permits recovery of CRISPR/Cas9-induced mutations in essential genes. Development. 143 (15), 2868-2875 (2016).
- Koslová, A., et al. Precise CRISPR/Cas9 editing of the NHE1 gene renders chickens resistant to the J subgroup of avian leukosis virus. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (4), 2108-2112 (2020).
- Zhang, F. Efficient generation of zebrafish maternal-zygotic mutants through transplantation of ectopically induced and Cas9/gRNA targeted primordial germ cells. J Genet Genom. 47 (1), 37-47 (2020).
- Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. Stages of Drosophila Embryogenesis. The Embryonic Development of Drosophila. , (1997).
- Manning, A. A sperm factor affecting the receptivity of Drosophila melanogaster females. Nature. 194, 252-253 (1962).
- Kubli, E. Sex-peptides: seminal peptides of the Drosophila male. Cell Mol Life Sci. 60, 1689-1704 (2003).
- Lehmann, R., Nüsslein-Volhard, C. Abdominal segmentation, pole cell formation, and embryonic polarity require the localized activity of oskar, a maternal gene in drosophila. Cell. 47 (1), 141-152 (1986).
- Kiger, A. A., Gigliotti, S., Fuller, M. T. Developmental genetics of the essential Drosophila Nucleoporin nup154: allelic differences due to an outward-directed promoter in the P-element 3′ end. Genetics. 153 (2), 799-812 (1999).
- Rienzi, L. F., et al. Perspectives in gamete and embryo cryopreservation. Semin Reprod Med. 36 (5), 253-264 (2018).
