In questo protocollo, vengono descritti i metodi rilevanti per la metabolomica arterovenosa ottimizzata per BAT utilizzando GC-MS in un modello murino. Questi metodi consentono l'acquisizione di preziose informazioni sullo scambio di metaboliti mediati da BAT a livello di organismo.
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Articolo metodologico
Metabolomica arterovenosa per misurare lo scambio di metaboliti in vivo nel tessuto adiposo bruno
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il tessuto adiposo bruno (BAT) svolge un ruolo cruciale nella regolazione dell'omeostasi metabolica attraverso un processo di dispendio energetico unico noto come termogenesi senza brividi. Per raggiungere questo obiettivo, BAT utilizza un menu diversificato di nutrienti circolanti per supportare la sua elevata domanda metabolica. Inoltre, BAT secerne fattori bioattivi derivati da metaboliti che possono fungere da combustibili metabolici o molecole di segnalazione, facilitando la comunicazione intratissutale e/o intertissutale mediata da BAT. Ciò suggerisce che BAT partecipi attivamente allo scambio sistemico di metaboliti, una caratteristica interessante che sta iniziando ad essere esplorata. Qui, introduciamo un protocollo per la metabolomica arterovenosa BAT ottimizzata a livello di topo in vivo . Il protocollo si concentra su metodi rilevanti per le stimolazioni termogeniche e su una tecnica di prelievo di sangue arterovenoso utilizzando la vena di Sulzer, che drena selettivamente il sangue venoso interscapolare derivato da BAT e il sangue arterioso sistemico. Successivamente, viene dimostrato un protocollo metabolomico basato sulla gascromatografia che utilizza quei campioni di sangue. L'uso di questa tecnica dovrebbe ampliare la comprensione dello scambio di metaboliti regolati dalle BAT a livello interorgano, misurando l'assorbimento netto e il rilascio di metaboliti da parte delle BAT.
Introduzione
Il tessuto adiposo bruno (BAT) possiede una proprietà unica di dispendio energetico nota come termogenesi non tremante (NST), che coinvolge sia i meccanismi dipendenti dalla proteina di disaccoppiamento mitocondriale 1 (UCP1) che quelli indipendenti da UCP1 1,2,3,4,5. Queste caratteristiche distintive implicano BAT nella regolazione del metabolismo sistemico e nella patogenesi delle malattie metaboliche, tra cui l'obesità, il diabete di tipo 2, le malattie cardi....
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Protocollo
Tutti gli esperimenti sono stati condotti con l'approvazione del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università di Sungkyunkwan (IACUC). I topi sono stati alloggiati in una struttura per animali approvata dalla IACUC situata in una camera bianca impostata a 22 °C e 45% di umidità, seguendo un ciclo giornaliero di luce/buio di 12 ore. Erano tenuti in rastrelliere ventilate e avevano accesso a una dieta standard ad libitum (comprendente il 60% di carboidrati, il 16% di proteine e il 3% di grassi). La lettiera e i materiali per la nidificazione sono stati cambiati su base settimanale. Per questo studio sono stati utilizzati topi maschi C57BL/6J ....
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Risultati
La Figura 1 illustra lo schema sperimentale della metabolomica AV ottimizzata per BAT. Come accennato nella sezione Protocollo, per ottenere tessuti adiposi bruni stimolati in modo differenziale, i topi vengono sottoposti ad acclimatazione termica utilizzando incubatrici per roditori o ricevono somministrazione farmacologica come agonisti del recettore β-adrenergico. Successivamente, i topi vengono anestetizzati e vengono raccolti campioni di sangue per l'analisi metabolomica (
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Discussione
Un passo fondamentale per comprendere il potenziale metabolico del BAT nell'equilibrio energetico di tutto il corpo è definire quali nutrienti consuma, come vengono metabolicamente elaborati e quali metaboliti vengono rilasciati nella circolazione. Questo protocollo introduce una tecnica specializzata di campionamento arterovenoso che consente l'accesso alla vascolarizzazione venosa del BAT interscapolare e alla vascolarizzazione arteriosa sistemica nei topi C57BL/6J, che è stata recentemente sviluppata e convalidata da .......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse da segnalare.
Ringraziamenti
Ringraziamo tutti i membri dei laboratori Choi e Jung per la discussione metodologica. Ringraziamo C. Jang e D. Guertin per i consigli e i feedback. Si ringrazia M.S. Choi per la lettura critica del manoscritto. Questo lavoro è stato finanziato da NRF-2022R1C1C1012034 a S.M.J.; NRF-2022R1C1C1007023 a D.W.C; NRF-2022R1A4A3024551 a S.M.J. e D.W.C. Questo lavoro è stato supportato dalla Chungnam National University per W.T.K. La Figura 1 e la Figura 2 sono state create utilizzando BioRender (http://biorender.com/).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 0,5-20 & micro; L Punte Filtro | Axygen | AX. TF-20-R-S | |
| Siringa da 1 mL con ago inserito - 26 G 5/8" | BD Biosciences | 309597 | |
| Agilent 5977B GC/MSD (rivelatore selettivo di massa) | Agilent | G7077B | |
| Autocampionatore Agilent 7693A | Agilent | G4513A | |
| Agilent 8890 GC System | Agilent | G3542A | |
| Agilent J& Colonna W GC (colonna capillare) HP-5MS UI | Agilent | 19091S-433UI | |
| Agilent MassHunter Workstation software_MS Analisi quantitativa (Quant-My-way) | Agilent | G3335-90240 | |
| C57BL/6J mouse | DBL | C57BL/6JBomTac | |
| CentriVap -50 ° C Trappola per il freddo (con coperchio in acciaio inossidabile) | LABCONCO | ||
| DL-Norvaline | Sigma-Aldrich | N7502-25G | |
| Eppendorf centrifuga 5430R | Eppendorf | 5428000210 | |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes 1,5 mL | Eppendorf | 30120086 | |
| Inserto in vetro 250 μ L | Agilent | 5181-1270 | |
| Metanolo (grado LC-MS) | Sigma-Aldrich | Q34966-1L | |
| Metossiammina cloridrato | Sigma-Aldrich | 226904-5G | |
| Microvette 200 Siero, 200 µ L, tappo rosso, base piatta | Sarstedt | 20.1290.100 | |
| MTBSTFA | Sigma-Aldrich | 394882-100ML | |
| Piridina (anidra, 99,8%) | Sigma-Aldrich | 270970-100ML | |
| Concentratori a vuoto completi refrigerati CentriVap | LABCONCO | ||
| Dieta per roditori | SAFE | SAFE R+40-10 | |
| Incubatrice per roditori | Power scientific | RIT33SD | |
| Aghi per penna ultrasottili - 29 G 1/2" | BD Biosciences | 328203 | |
| Tappo per fiala 9 mm | Agilent | 5190-9067 | |
| Fiale, ambr scrw wrtn 2 mL | Agilent | 5190-9063 | |
| Fiale, ambr scrw wrtn 2 mL+A2:C40 | Axygen | PCR-02-C |
Riferimenti
- Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: function and physiological significance. Physiol Rev. 84 (1), 277-359 (2004).
- Ikeda, K., et al. UCP1-independent signaling involving SERCA2b-mediated calcium cycling ....
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Ristampe e permessi
