I detta protokoll beskrivs metoder som är relevanta för BAT-optimerad arteriovenös metabolomik med GC-MS i en musmodell. Dessa metoder gör det möjligt att få värdefulla insikter om BAT-medierat metabolitutbyte på organismnivå.
Brun fettvävnad (BAT) spelar en avgörande roll för att reglera metabolisk homeostas genom en unik energiförbrukningsprocess som kallas icke-skakande termogenes. För att uppnå detta använder BAT en varierad meny av cirkulerande näringsämnen för att stödja sitt höga metaboliska behov. BAT utsöndrar dessutom bioaktiva faktorer som härrör från metaboliter och som kan fungera som antingen metaboliska bränslen eller signalmolekyler, vilket underlättar BAT-medierad kommunikation inom och/eller mellan vävnader. Detta tyder på att BAT aktivt deltar i det systemiska metabolitutbytet, en intressant egenskap som börjar utforskas. Här introducerar vi ett protokoll för in vivo optimerad BAT arteriovenös metabolomik på musnivå. Protokollet fokuserar på relevanta metoder för termogena stimuleringar och en arteriovenös blodprovstagningsteknik med hjälp av Sulzers ven, som selektivt dränerar interscapular BAT-härlett venöst blod och systemiskt arteriellt blod. Därefter demonstreras ett gaskromatografibaserat metabolomikprotokoll med hjälp av dessa blodprover. Användningen av denna teknik bör öka förståelsen av BAT-reglerat metabolitutbyte mellan organ genom att mäta nettoupptag och frisättning av metaboliter genom BAT.
Brun fettvävnad (BAT) har en unik energiförbrukningsegenskap som kallas icke-skakande termogenes (NST), som involverar både mitokondriellt frikopplingsprotein 1 (UCP1)-beroende och UCP1-oberoende mekanismer 1,2,3,4,5. Dessa särdrag innebär att BAT är inblandad i regleringen av systemisk metabolism och patogenesen av metabola sjukdomar, inklusive fetma, typ 2-diabetes, hjärt-kärlsjukdom och cancerkakexi 6,7,8. Nyligen genomförda retrospektiva studier har visat ett omvänt samband mellan BAT-massa och/eller dess metaboliska aktivitet med fetma, hyperglykemi och kardiometabol hälsa hos människor 9,10,11.
På senare tid har BAT föreslagits som en metabolisk sänka som ansvarar för att upprätthålla NST, eftersom den kräver betydande mängder cirkulerande näringsämnen som termogen bränsle6,7. BAT kan dessutom generera och frigöra bioaktiva faktorer, så kallade bruna adipokiner eller BATokiner, som fungerar som endokrina och/eller parakrina signaler, vilket indikerar dess aktiva inblandning i metabolisk homeostas på systemnivå 12,13,14,15. Att förstå BAT:s näringsmetabolism bör därför öka vår förståelse för dess patofysiologiska betydelse hos människor, utöver dess konventionella roll som ett termoreglerande organ.
Metabolomikstudier med stabila isotopspårämnen, i kombination med klassiska studier av näringsupptag med icke-metaboliserbara radioaktiva spårämnen, har avsevärt förbättrat vår förståelse av vilka näringsämnen som företrädesvis tas upp av BAT och hur de utnyttjas 16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27. Studier av radioaktiva spårämnen har till exempel visat att köldaktiverad BAT tar upp glukos, lipoproteinbundna fettsyror och grenade aminosyror 16,17,18,19,20,21,22,23,27. Nyligen genomförd isotopspårning i kombination med metabolomiska studier har gjort det möjligt för oss att mäta det metaboliska ödet och flödet av dessa näringsämnen i vävnader och odlade celler 24,25,26,28,29,30. Dessa analyser fokuserar dock främst på det individuella utnyttjandet av näringsämnen, vilket ger oss begränsad kunskap om BAT:s roll på systemnivå i organmetabolitutbytet. Frågor om den specifika serie av cirkulerande näringsämnen som förbrukas av bästa tillgängliga teknik och deras kvantitativa bidrag i form av kol och kväve är fortfarande svårfångade. Dessutom har undersökningen av huruvida BAT kan generera och frisätta metabolithärledda BATokiner (t.ex. lipokiner) med hjälp av näringsämnen precis börjat 12,13,14,15,31,32.
Arteriovenös blodanalys är en klassisk fysiologisk metod som används för att bedöma det specifika upptaget eller frisättningen av cirkulerande molekyler i organ/vävnader. Denna teknik har tidigare tillämpats på den interscapulära BAT hos råttor för att mäta syre och flera metaboliter, och därigenom etablera BAT som den viktigaste platsen för adaptiv termogenes med dess katabola potential 33,34,35,36,37. Nyligen kombinerades en arteriovenös studie med interscapulär BAT på råtta med en trans-omics-metod, vilket ledde till identifiering av oupptäckta BATokiner som frigörs av termogent stimulerad BAT38.
De senaste framstegen inom högkänslig gaskromatografi- och vätskekromatografi-masspektrometri (GC-MS och LC-MS)-baserad metabolomik har återuppväckt intresset för arteriovenösa studier för kvantitativ analys av organspecifikt metabolitutbyte 39,40,41. Dessa tekniker, med sin höga upplösningsförmåga och massnoggrannhet, möjliggör omfattande analys av ett brett spektrum av metaboliter med hjälp av små provmängder.
I linje med dessa framsteg har man i en nyligen genomförd studie framgångsrikt anpassat arteriovenös metabolomik för att studera BAT på musnivå, vilket möjliggör kvantitativ analys av metabolitutbytesaktiviteter i BAT under olika förhållanden42. Den här artikeln presenterar ett BAT-riktat arteriovenöst metabolomikprotokoll med GC-MS i en C57BL/6J-musmodell.
Ett viktigt steg för att förstå BAT:s metaboliska potential i hela kroppens energibalans är att definiera vilka näringsämnen den konsumerar, hur de metaboliskt bearbetas och vilka metaboliter som släpps ut i cirkulationen. Detta protokoll introducerar en specialiserad arteriovenös provtagningsteknik som möjliggör tillgång till den venösa vaskulaturen av interscapular BAT och systemisk arteriell vaskulatur i C57BL/6J-möss, som nyligen utvecklades och validerades av Park et al42. Nedan …
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar alla medlemmar i Choi- och Jung-laboratorierna för metodologiska diskussioner. Vi tackar C. Jang och D. Guertin för råd och feedback. Vi tackar M.S. Choi för kritisk läsning av manuskriptet. Detta arbete finansierades av NRF-2022R1C1C1012034 till S.M.J.; NRF-2022R1C1C1007023 till D.W.C; NRF-2022R1A4A3024551 till S.M.J. och D.W.C. Detta arbete stöddes av Chungnam National University för W.T.K. Figur 1 och Figur 2 skapades med hjälp av BioRender (http://biorender.com/).
0.5-20 µL Filter Tips | Axygen | AX.TF-20-R-S | |
1 mL Syringe with attached needle – 26 G 5/8" | BD Biosciences | 309597 | |
Agilent 5977B GC/MSD (mass selective detector) | Agilent | G7077B | |
Agilent 7693A Autosampler | Agilent | G4513A | |
Agilent 8890 GC System | Agilent | G3542A | |
Agilent J&W GC column (Capilary column) HP-5MS UI | Agilent | 19091S-433UI | |
Agilent MassHunter Workstation software_MS Quantitative analysis(Quant-My-way) | Agilent | G3335-90240 | |
C57BL/6J mouse | DBL | C57BL/6JBomTac | |
CentriVap -50 °C Cold Trap (with Stainless steel Lid) | LABCONCO | 7811041 | |
DL-Norvaline | Sigma-Aldrich | N7502-25G | |
Eppendorf centrifuge 5430R | Eppendorf | 5428000210 | |
Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 mL | Eppendorf | 30120086 | |
Glass insert 250 μL | Agilent | 5181-1270 | |
Methanol (LC-MS grade) | Sigma-Aldrich | Q34966-1L | |
Methoxyamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 226904-5G | |
Microvette 200 Serum, 200 µL, cap red, flat base | Sarstedt | 20.1290.100 | |
MTBSTFA | Sigma-Aldrich | 394882-100ML | |
Pyridine(anhydrous, 99.8%) | Sigma-Aldrich | 270970-100ML | |
Refrigerated CentriVap Complete Vaccum Concentrators | LABCONCO | 7310041 | |
Rodent diet | SAFE | SAFE R+40-10 | |
Rodent incubator | Power scientific | RIT33SD | |
Ultra-Fine Pen Needles – 29 G 1/2" | BD Biosciences | 328203 | |
Vial Cap 9 mm | Agilent | 5190-9067 | |
Vial, ambr scrw wrtn 2 mL | Agilent | 5190-9063 | |
Vial, ambr scrw wrtn 2 mL+A2:C40 | Axygen | PCR-02-C |